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1、基因生物工程第六节重组体的筛选与鉴定原则 转化子 接纳载体或重组分子的转化细胞 重组子 含有重组DNA分子的转化细胞 如果重组子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望克隆子 选择 selection 通过外来附加压力 或因素 的辨别作用 呈现具有重组DNA分子的特定克隆类型的一种方法 筛选 screening 通过特定的方法 例如核酸杂交以及免疫测定 从被分析的细胞群体或基因文库中 鉴定出真正是所需重组DNA分子的特定克隆过程由于被筛选的大量的菌落和噬菌斑当中 仅有很少的比例含有期望的重组DNA分子 因此需要使用高度敏感和高度特异的筛选方法 外源DNA 载体DNA 重组分子 原核细胞 真核
2、细胞 扩增或表达 表达 连接 转化或转导 电穿孔或显微注射 受体细胞 DNA的体外重组 获得转化子仍然是多种类型的DNA分子1连接产物中既有载体和一个或多个串联目的基因的连接 2也有载体自连 3还有目的DNA分子自连 4更多的是未发生连接反应的载体和目的DNA片段 一 遗传检测法报告基因筛选 抗性标志插入失活筛选 半乳糖苷酶蓝白斑筛选 插入基因遗传性状筛选 二 分子检测法PCR扩增检测分子杂交检测三 物理检测法DNA电泳检测限制酶酶切分析法四 免疫化学检测法五 核酸序列分析 平板筛选 重组子的筛选与鉴定 一 遗传学检测法 1根据载体表型特征筛选重组子分子的直接选择法A抗药性标记插入失活选择法B
3、 半乳糖苷酶显色法 2根据插入序列的表型特征选择重组子的直接选择法转化进来的外源DNA编码的基因 能够对大肠杆菌寄主所具有的突变体发生体内抑制或者互补效应 从而使被转化的寄主细胞表现出外源基因编码的表性特征 Ampr A 插入失活筛选 在质粒固有的功能基因内插入目的基因 则该基因不能表达有功能的蛋白质 原理 例1在Tetr中插入目的基因 1 四环素 抑制细菌生长 但不杀死细菌 2 氨苄青霉素抗性基因 产生 内酰胺酶 使氨苄青霉素转变为青霉酮酸 3 环丝氨酸 杀死生长的细菌 但不杀死停止生长的细菌 pBR322抗菌素标记选择原理 如果在Tetr上插入外源DNA 导致四环素抗性基因失活 可用四环素
4、加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆 Tetr失活的菌生长被四环素抑制 不被环丝氨酸杀死 保留下来 Tetr不失活的菌抗四环素 能分裂生长 反而被环丝氨酸杀死 无环丝氨酸培养基 环丝氨酸辅助筛选 氨苄青霉素抗性插入失活选择过程 如果Ampr上插入外源DNA 导致氨苄青霉素抗性基因失活 可用碘 青霉素指示液选择 pUC18 19 B lacZ与蓝白斑筛选 例2在LacZ中插入目的基因 半乳糖苷酶显色反应选择法 半乳糖苷酶 乳糖 半乳糖 葡萄糖 Xgal 半乳糖 5 溴 4 氯靛蓝 深蓝色 1 原理 载体上有一段 半乳糖苷酶基因 LacZ 的 片段 氨基端 其上有外源DNA的插入位点 受体菌基因组中有
5、突变的 半乳糖苷酶基因 片段缺失 可以被IPTG 诱导物 诱导表达 载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的 半乳糖苷酶 假阳性 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有中止密码 不破坏 肽 2 选择过程 通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入 MCS无插入时 互补 蓝菌斑 MCS有插入时 不互补 白菌斑 IPTG诱导的结果 利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择 只在特定条件下 转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷 1 原理 2 根据插入基因的遗传表型筛选 弥补缺陷 his his 受体菌 外源基因 在不含组氨酸的培养基中生长 小鼠的二氢叶酸还原酶 D
6、HFR 对三甲氧苄二氨嘧啶 三甲氧苄氨嘧啶 TMP 抑制二氢叶酸还原酶 干扰二氢叶酸的合成 使细菌或球虫的核酸合成受阻 有抗性 DHFR 载体 连接 转化受体菌 三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板 含DHFR的克隆才能生长 例 使被转化的受体菌表现出外源基因的表型 增加新性状 利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大 1 直接电泳检测法 从转化后的菌体克隆中分离质粒 电泳 比较其分子量 DNA电泳检测法 分子量Marker 载体 重组克隆 三 物理检测法 根据重组DNA分子大小鉴定重组子原理 有外源DNA片段插入载体后的重组DNA与载体DNA之间的大小差异 基本方法 提取转化子的DNA 经
7、琼脂糖凝胶电泳分离 电泳迁移慢的带是重组DNA的带 此法是对重组子进行分析鉴定的最基本 最简单的方法 只适用于重组子的初步鉴定 2 酶切电泳筛选法 原理 根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱 选择一两种内切酶切割质粒 电泳后比较电泳结果 DNA带数和长度 或用合适的内切酶切下插入片断 再用其它酶切这个片断 电泳后比较结果是否符合预计的结果 A B A或B 筛选过程 二 分子检测法 PCR扩增检测分子杂交检测 PCR扩增检测法 1 原理 PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断 2 过程 1 从重组克隆中提取质粒 或DNA 2 用外源DNA插入片断作PCR引物 3 电泳PCR产物 4 检查是
8、否有PCR产物 5 PCR产物的长度是否与外源基因一致 例PCR检测 PCR检测外源基因的原理是根据被转移的外源基因 目的基因或选择标记基因 设计引物 扩增外源基因的片段 如果扩增出的片段与设计的一对引物之间的实际片段在长度上相吻合 说明基因已转入受体细胞 在进行PCR检测时应设两个对照 阳性对照即质粒DNA和阴性对照即非转基因材料的DNA PCR扩增结果只能初步确定转基因材料的真实性 并不能完全确信 容易出现假阳性 通常需要进一步用Southern杂交才能证实 DNA序列分析鉴定 具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下按碱基互补配对原则退火形成双链的过程 杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列
9、 已知核酸序列且已标记的DNA或RNA 称探针 杂交有固一液相杂交和液相杂交 核酸分子杂交的基本原理 核酸分子杂交技术 四 原位杂交1 定义 将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交 称原位杂交 根据探针与待检核酸分 DNA DNA RNA DNA RNA RNA杂交探针 Probe 的概念 一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列 1 菌落印记原位杂交筛选 特点 对应的菌斑或噬菌斑位置不变 可以直接找出阳性菌落 此技术由Southern1975年首先设计 被检测对象为DNA 用DNA 或RNA 探针检测DNA样品 从宿主细胞中提取DNA 或质粒载体 再用探针
10、杂交 只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交 在底片上曝光显示 2 Southernblotting PaperTowels SouthernBlotting tissue SDS 蛋白酶K 酚 氯仿 无水乙醇离心 带有DNA片段的凝胶 Southern印迹杂交的技术流程 白瓷盘 玻璃板 滤纸 凝胶 尼龙膜 滤纸 吸水纸 玻璃板 重物 吸水纸转膜 转膜的几种方式 3 Northernblotting 用DNA 或RNA 探针检测RNA样品 主要检测插入片断是否被转录 从宿主细胞中提取RNA 再用探针杂交 利用抗体作为 探针 来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因 根据第一抗体 一抗
11、 和第二抗体 二抗 的性质可分为几种作用方式 1 放射性抗体检测法 五 免疫化学检测法 1 抗体与产物的结合方式 对表达产物的检测 蛋白 蛋白 杂交 待测基因产物蛋白 一抗 二抗 125I标记的二抗结合蛋白 固相支持滤膜 待测基因产物蛋白 一抗 125I标记的二抗 固相支持滤膜 待测基因产物蛋白 一抗 固相支持滤膜 固相支持滤膜 待测基因产物蛋白 一抗 二抗 125I标记的二抗结合蛋白 125I标记的二抗 2 放射性抗体检测法过程 2 Broome Gilbert双位点检测法 质粒基因A 插入基因B 表达 质粒蛋白A 外源蛋白B 融合蛋白 检测融合蛋白 既检测外源基因产物又检测载体基因产物 固
12、相支持滤膜 抗A抗体 125I标记的抗B抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B 质粒蛋白A 外源蛋白B 固相支持滤膜 抗A抗体 发光 底片曝光 3 免疫沉淀检测法 把非放射性抗体加到平板培养基中 当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时 就会与抗体反应形成 沉淀圈 1 原理 抗原 抗体凝集反应 检测分泌型产物 2 方法 对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理 溶菌酶 原噬菌体诱发 4 酶联免疫吸附测定 ELISA Enzyme linkedimmunosorbantassay 1 原理 一抗 primaryantibody 与目标分子的特异结合 二抗 secondaryantibody 与
13、一抗的特异性结合 酶连 enzyme linke 二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质 或发光 再通过比色测定有色物质的含量 或光强度 从而推测目标分子的含量 待测基因产物蛋白 一抗 二抗 酶 待测基因产物蛋白 一抗 二抗 无色的底物 有色的产物 比色观察 酶 2 ELISA检测的一般步骤 固定样品 将待测样品加入96孔微量滴定板 microtiterplate 的孔中 干燥后就被固定在孔底 一抗结合 加入一抗 反应后冲洗掉未结合的抗体 孔底 一抗 加入二抗 与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉 二抗只识别一抗 二抗上联着一种酶 碱性磷酸酶 过氧化物酶 脲酶等 二抗结合 二
14、抗 显色反应 加入无色的底物 被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质 或发光 比色 在特殊的分光光度仪 酶标仪 上比色 打印出结果 3 ELISA的局限性 有效 但准确性稍差 主要取决于一抗的特异性 必须与其他方法一起综合考虑 最好用单克隆抗体 monoclonalantibody 临床检验常用的单抗 5 免疫印迹 westernblotting 法 在蛋白质凝胶电泳以后 用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带 1 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS PAGE 是蛋白质的变性剂 使煮沸变性的蛋白质维持线性状态 并与蛋白质结合 使蛋白质带上负电荷 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE Polyac
15、rylamidegelelectrophoresis 在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动 移动的速率主要取决于其分子量大小 链的长短 从而把不同分子量的肽链分开 电泳buffer 电泳buffer 蛋白质电泳的分子量标准 已知分子量的蛋白质混合液 与待测样品一起电泳 为样品蛋白质提供分子量估计 商品化供应 Da 道尔顿 质量单位 等于一氧原子质量的十六分之一 一克约为6 1023道尔顿 凝胶中的蛋白质染色 考马斯亮蓝 灵敏度底 只能检出 0 3 1 g 带 但可褪色回收 硝酸银 灵敏度高 可检出2 5ng 带 转到膜上进行染色 直接染色 2 Westernblottin
16、g 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法 转到膜上 硝酸纤维素膜 PVDF膜 中性尼龙膜等 Western 转膜 胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移到正极一侧的膜上 膜 胶 蛋白 Western装置 Blotting 原理与ELISA相同 待测蛋白 硝酸纤维素膜 一抗 二抗 辣根过氧化物酶 底物 产物 并发出光 PAGE胶 待测蛋白 底片曝光 辣根过氧化物酶 HRPO 先用一抗 待测蛋白的单克隆抗体 与膜上的蛋白结合 洗去未结合的一抗 用二抗与一抗结合 二抗上带有HRPO 清洗掉未结合的二抗 用HRPO的底物浸泡膜 暗室里曝光 冲洗胶片 Blotting过程 结果 多克隆抗体Blotting的结果 单抗blotting结果 六 转译筛选法 1 无细胞翻译系统 能把外源的mRNA翻译成蛋白质的细胞提取物 如 麦胚提取物系统 网织红细胞提取物系统 借助无细胞翻译系统 通过表达或抑制所选择的克隆载体上的外源基因的转录 来筛选其产物是否符合预期 适用于mRNA转录丰度高的外源基因 2 转译筛选 mRNA 无细胞翻译系统 35S标记的甲硫氨酸 翻译 35S标记的肽链 PAGE电泳 放射自显影 比
