第十一章克隆基因在真核生物中的表达

《第十一章克隆基因在真核生物中的表达》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第十一章克隆基因在真核生物中的表达（141页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、第十一章克隆基因在真核生物中的表达 真核表达系统是指利用真核生物细胞作为外源基因表达宿主的一类基因表达系统 常用的真核系统包括酵母 丝状真菌 昆虫类 植物和哺乳动物细胞等表达系统 本章主要是关于酵母表达系统 目前 E Coli等原核表达系统以其易于操作 遗传背景清楚 发酵成本低和蛋白表达水平高等优点 依然是生产重组蛋白的首选外源基因表达系统 但是我们为什么要发展真核表达系统呢 第一节真核表达系统的发展 使克隆基因在细胞中表达对理论的研究以及实验的应用都具有十分重要意义的 克隆的基因只有通过表达才能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理 克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究 有

2、些具有特定生物活性的蛋白质在医学上 以至在工业上都是很有应用价值的 可以通过克隆其基因使之在宿主细胞中大量表达而获得 第一节 要使克隆基因在宿主细胞中表达 就要将它放入带有基因表达所需要的各种元件的载体中 这种载体就称为表达载体 expressionvector 克隆基因可以放在不同的宿主细胞中表达 可以利用大肠杆菌 枯草杆菌 酵母 丝状真菌 昆虫细胞 培养的哺乳类动物细胞 以至整体动物作为表达宿主 对不同的表达系统 需要构建不同的表达载体 克隆基因在不同的系统中表达成功的把握性 取决于我们对这些系统中宿主基因表达调控规律的认识程度 人类对大肠杆菌经过长期的研究 对其特性和遗传背景了解得最清楚

3、 大肠杆菌培养操作简单 生长繁殖快 价格低廉 人们用大肠杆菌用外源基因的表达工具已有二十多年的经验积累 大肠杆菌表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统 表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80 因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统 真核基因在大肠杆菌中表达体系的不足 1 真核基因 在结构上同原核基因之间存在着很大的差别 2 真核基因的转录信号同原核的不同 细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子 外源基因可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列 3 真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异 影响真核基因mRNA稳定性 4 许多真核基因的蛋白质产物 都要经过转译后的加工修

4、饰 正确折叠和组装 而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中并不存在 5 细菌的蛋白酶 能够识别外来的真核基因所表达的蛋白质分子 并把它们降解掉 真核基因放入原核细胞中表达产生蛋白质时的不足没有真核转录后加工的功能 不能进行mRNA的剪接 所以只能表达cDNA而不能表达真核的基因组基因 没有真核翻译后加工的功能 表达产生的蛋白质 不能进行糖基化 磷酸化等修饰 难以形成正确的二硫键配对和空间构像折叠 因而产生的蛋白质常没有足够的生物学活性 表达的蛋白质经常是不溶的 容易在细菌内聚集成包涵体 inclusiionbody 什么是包含体 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集 形成无活性的固体颗粒 包涵体的

5、组成与特性 一般含有50 以上的重组蛋白 其余为核糖体元件 RNA聚合酶 外膜蛋白OMPC等 还夹杂有环状或缺口的质粒DNA 以及脂体 脂多糖等 大小为0 5 1um 难溶与水 只溶于变性剂如尿素 脲 盐酸 大肠杆菌包含体的形成 原核生物中当表达目的蛋白量超过细菌体总蛋白量10 时 就很容易形成包涵体 包涵体是无生物活性的不溶性蛋白 要经过复性 renaturation 使其重新散开 重新折叠成具有天然蛋白构象和良好生物活性的蛋白质 常常是一件很困难的事情 也是蛋白质产业化的瓶颈 也可以设计载体使大肠杆菌分泌表达出可溶性目的蛋白 但表达量往往不高 可见尽管原核生物 大肠杆菌 表达系统有众多的优

6、点 但并非每一种基因都能在其中有效表达 也没有一种表达系统能对所有的基因进行表达 真核基因表达调控复杂性的 远超出我们的了解 因此发展多种真核表达系统在理论研究核实际应用都具有非常重要的意义 发展真核表达系统的必要性及其优势1 具转录后加工系统2 具翻译后修饰系统3 可实现真正的分泌表达4 真核生物的基因工程5 基因治疗 自从1979年开始 科学家为了克服大肠杆菌表达系统表达真核基因的缺点 开始利用酵母来作为表达系统 由于酿酒酵母与人的生活和生产密切相关 没有致病性 具有和大肠杆菌一样容易的培养方式 又具有真核生物翻译后的修饰功能 所以成为首选的表达宿主 RecombinantHumanInt

7、erferon 1981年首先将人的a 干扰素基因实现在酵母中成功表达 第二节真核基因的表达与调控真核基因的表达与调控是一个多水平 包括转录前 转录 转录后 翻译 翻译后 的复杂调控过程 一 真核生物基因的表达调控的特点1 DNA量大 不存在操纵子结构 2 真核细胞的编码基因大多是不连续的 由外显子和内含子镶嵌排列而成 外显子 exon 为蛋白质氨基酸编码的DNA序列 内含子 intron 插入到编码序列之间的非编码序列 内含子功能 含调控序列 参与基因表达 提供变异机会 与进化有关 真核的mRNA单顺反子 多内含子 寿命比原核mRNA的长 内含子 intron 也称内元 在原初转录物中 通过

8、RNA拼接反应而被去除的RNA序列 或基因中与这种序列对应的DNA序列 外显子 exon 也称外元原初转录物通过RNA拼接反应后 而保留于成熟RNA中的序列 或基因中与成熟RNA对应的DNA序列 TATA盒 翻译起始植物C GAANNATGG动物A GNNATGG 各内含子 加poly A 信号植物G AATAA1 3动物AATAAA 终止密码子 各个外显子 AGGA或CAAT盒 加帽位点5 m7GpppNp 5 端 真核基因的一般结构 真核生物基因表达过程示意图 真核生物结构基因示意图 真核生物基因的结构特点 可见 真核生物基因的转录和翻译具有时间和空间上的分隔 上述真核生物基因转录后的剪切

9、 拼接和转移等过程 都需要有调控序列的调控 这种调控作用是原核生物所没有的 二 转录前表达调控发生在基因组水平上的基因结构的改变 包括基因丢失 基因扩增 基因重排 甲基化修饰及染色质结构影响 三 转录水平的调控主要涉及3种因素的相互作用 1 RNA聚合酶2 顺式调控元件3 反式作用因子 1 RNA聚合酶 RNApolyperase RNApol 真核生物RNApol有3种 RNApol 存在于核仁 转录产物为rRNA 5 8s 18s 28s RNApol 存在于核质 转录产物为mRNA及其他一些功能不明的小分子量RNA RNApol 存在于核质 转录产物为tRNA和5sRNA 与真核生物不同

10、的是原核生物一种RNA聚合酶 合成各种RNA mRNA tRNA rRNA 一个E coli细胞中约有7000个RNA聚合酶分子 在任一时刻 大部分聚合酶 5000左右 正在参与RNA的合成 E coliRNA聚合酶全酶 holoenzyme 分子量46万Da 由六个亚基组成 2 另有两个Zn2 无 亚基的酶叫核心酶 核心酶只能使已开始合成的RNA链延长 而不具备起始合成活性 加入 亚基后 全酶才具有起始合成RNA的能力 因此 亚基称为起始因子 不同的原核生物 亚基分子量变化不大 亚基分子量变化较大 44KD 92KD 不同的 因子识别不同的启动子 从而表达不同的基因 不同的原核生物 都具有相

11、同的核心酶 但 亚基有所差别 这决定了原核基因表达的选择性 真核基因和原核基因RNA聚合酶的差异说明了什么呢 这说明了一个问题 真核基因和原核基因的启动子有很大的差异 两者是不能互用 特别是原核生物的启动子很难被真核生物的转录系统识别 而真核基因的表达的时空调控性更加说明真核表达系统启动子的使用更为严格 2 顺式调控元件顺式调控元件 cis actingelement CAE 与结构基因串联的特定的DNA系列 1 启动子 promoter 与基因转录启动有关的核心序列 真核启动子真核基因的转录十分复杂 对启动子的分析要比原核基因的困难得多 真核生物有三种RNA聚合酶 RNA聚合酶I II II

12、I 分别转录rRNA mRNA tRNA和小分子RNA 这三类聚合酶的启动子各有其结构特点 真核生物启动子分为3类 分别结合3种不同的RNApol 这其中也需要3种不同的转录因子 即TF TF 和TF Goldberg Hogness盒 Hogness盒 TATA盒 核心序列为TATAATAAT 位于转录起始位点 30bp区域 TATA盒主要通过与TATA盒结合蛋白 TATAboxbindingprotein TBP 以及TBP相关因子 TBPassociatedfactor TAF 的相互作用而发挥功能 其功能有3 决定了转录的精确起始 介导转录起始复合物的形成 在某些启动子中决定转录的方向

13、 TATA框 Hogness框 中心在 25至 30 长度7bp左右 碱基频率 T82A97A85A63 T37 A83A50 T37 全为A T 少数含有一个G C对 此序列功能 使DNA双链解开 并决定转录的起点位置 失去TATA框 转录将可能在许多位点上开始 TATA框的改变或缺失 直接影响DNA与酶的结合程度 会使转录起始点偏移 因此 TATA是绝大多数真核基因正确表达所必需的 由于RNA聚合酶分子有相对固定的空间结构 同此框的结合位点和转录反应催化位点的距离 决定了起始位点的正确选择 启动子特定序列和酶的正确结构 这两者把酶置于一种正确的构象中 决定了识别的正确性和转录起始的正确性

14、上游启动子元件 upstreampromoterelement URS 包括CAAT盒和GC盒 位于转录起始位点中心在 75处 9bp 共有序列GGT G CAATCT功能 与RNA聚合酶结合 与TATA盒协同作用 决定了基因的基础转录效率 GC框在CAAT框上游 序列GGGCGG 与某些转录因子结合 CAAT和GC框均为上游序列 对转录的起始频率有较大影响 2 增强子 enhancer 位于 200 300bp区域 由多个独立的 具有回文结构的核苷酸组成 以单拷贝或多拷贝的形式存在 促进基因转录活性 无方向性 远距离作用 无基因特异性 具有组织特异性 具有相位性 3 沉寂子 silencer

15、 和衰减子 dehancer 抑制基因转录 4 加尾信号 在polyA尾位点上游10 20bp处 常见1保守的AATAA序列 如去除此序列 基因会连续转录下去而不终止 polyA的功能 a 防止核酸外切酶对mRNA信息序列的降解 起缓冲作用 b 与mRNA从细胞核转移到细胞质有关 3 反式作用因子反式作用因子 trans actingfactor TAF 由位于不同染色体或同一染色体上相距较远的基因编码的蛋白质因子 CAE是TAF的结合位点 由于TAF结构上含有1个与DNA结合的结构域 能与特定的DNA序列结合 因此TAF也被称为DNA结合蛋白 DNAbindingprotien DBP 根据

16、TAF的作用方式 TAF可分为3类 1 普通转录因子 多数细胞中普遍存在的一类转录因子 如TATA盒结合因子TF D GC盒结合因子SP1等 2 组织特异性转录因子 基因表达的特异性很大程度上取决于组织特异性转录因子 3 诱导式反式作用因子 其活性可被特异的诱导因子所诱导 如cAMP结合转录因子 热休克转录因子 类固醇受体等 四 转录后水平的调控 1 戴 帽 capping 5 加上m7GpppN 防止降解 延长寿命 与核糖体小亚基结合 为翻译起始因子所识别 2 加 尾 tailing 3 加polyA 为mRNA进入细胞质所必须 保持mRNA稳定性 PABP polyA结合蛋白 polyAbindingprotein 3 拼接 splicing 拼接 splicing 将hnRNA 核不均一RNA 中的内含子序列切除 外显子部分连接起来 称为RNA拼接 五 翻译水平的调控 1 对可溶性蛋白因子的修饰如eIF 2磷酸化后 可抑制蛋白质的合成 2 对mRNA稳定性调节如催乳激素可使乳腺组织中的酪蛋白的半衰期提高20倍 3 反义RNA对翻译的调节反义RNA anti sense 一段含有与