第八章动物基因组学基础-医学资料

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1、1,第八章 动物基因组学基础,第一节 动物遗传标记 一 遗传标记的概念及其发展 （一）遗传标记的概念 遗传标记是指能够用以区别生物个体或群体及其特定基因型、并能稳定遗传的物质标志。 遗传标记是一些等位基因或遗传物质，能在生物体上以各种形式表现出各种变异。 遗传标记的概念经历了从宏观到微观、从外部到内部、从蛋白质到DNA的发展过程。,2,（二）遗传标记概念的发展 形态学标记 能用肉眼观察和识别的外部性状。例如，动物的毛色、角形、耳型、体型、外貌等。此法简单直观，但标记数目少、多态性低、易受环境影响。 细胞遗传标记 主要是指染色体核型（染色体的数目、大小、随体、着丝粒位置、核仁组织区等）、带型和数

2、量的变异。此法能反映出染色体结构和数目的多态性，但由于这些变异往往带来有害的表型效应，生物难以忍受。,3, 免疫遗传标记 以动物的免疫学特征为标记，主要是红细胞抗原多态性和白细胞抗原多态性。 红细胞抗原多态性血型，以细胞表面的抗原而定 白细胞抗原多态性主要组织兼容性复合体（MHC），以白细胞表面的抗原而定。 生化遗传标记（蛋白质多态性标记） 同一种动物中，具有相同功能的蛋白质存在两种以上的变异体，有些可以用电泳方法区分其中的差异。,4, 分子遗传标记 分子遗传标记是以DNA多态性为基础的遗传标记，又称DNA分子标记或多态性DNA标记。 自20世纪70年代以来，随着分子生物学的发展，相继建立了多

3、种分子遗传标记检测技术，例如，RFLP、VNTR、RAPD、AFLP、SNP等。 分子遗传标记的特点：遗传多态性高；检测方法简单快捷；遗传共显性，能分离出等位基因的三种基因型。,5,二、分子遗传标记 （一）限制性片段长度多态性（restiction fragment length polymorphism,RFLP） RFLP RFLP是1980年建立的第一代分子遗传标记。 原理：用限制性内切酶切割不同个体的DNA时，如果存在酶切位点的变化，就会产生长度不同的DNA片段，电泳后用克隆探针检测时，就会出现泳动行为的改变。 基本过程：取得DNA样本酶切电泳转移至硝酸纤维膜上DNA探针杂交放射自显影

4、,6,图7-1 Southern杂交过程,7,图7-2 RFLP检测,8, 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction , PCR） PCR是1985年建立的一种体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。 原理：在反应温度为9095时，DNA变性成为单链；反应温度降至4565时，两种引物与两条单链DNA退火而配对结合；反应温度升至72左右时，在TaqDNA聚合酶作用下，引物以单链DNA为模板逐步延伸成新的单链。“ 变性退火延伸”这一循环完成后，DNA复制了一次，由一个DNA分子成为两个DNA分子。,9,图7-3 DNA 扩增原理,10, PCRRFLP 如果已知多态性位点

5、周围的DNA序列，则可用PCR快速而简单地进行RFLP分析。 首先根据多态位点两侧序列设计和合成引物；以基因组DNA为模板进行PCR扩增；用相应的内切酶进行消化；再进行电泳，分析PCR区带判断多态性。,11,图7-4 PCRRFLP,12,（二）串联重复序列标记（tandem repeated sequence,TRS） 真核基因组序列 单一序列 短片段重复序列（正向重复、反向重复、回文序列） 长片段重复序列（轻度重复、中度重复、高度重复）,13,高度重复序列 卫星DNA（satellite DNA） 序列中G-C含量约30%，远低于基因组中主体DNA （G-C含量约42%）。将DNA切成片段

6、进行氯化铯密度梯度离心时，由于富含A-T浮力密度小，形成一条窄带在主体DNA外面，故称卫星DNA。 小卫星DNA（minisatellite DNA） 微卫星DNA（microsatellite DNA）,14,图7-6 卫星DNA,15,小卫星标记 小卫星DNA是一种可变数量的串联重复（varible number of tandem repeats, VNTR），在不同个体和基因组的不同位点上数目都不同。 用内切酶把总DNA切成不同长度的片段（VNTR上没有酶切位点），再以VNTR中的特殊序列为探针进行Southern杂交，由于不同个体的这种串联重复的数目及位置不同，所以VNTR的Sout

7、hern杂交谱带具有高度的个体特异性，故又称其为DNA指纹（DNA fingerprints）。,16, 微卫星标记 微卫星DNA又称短串联重复序列（STR），重复单位的核心序列为26 bp。 以微卫星DNA两侧特异性序列设计探针，用PCR技术扩增微卫星片段，扩增产物经电泳分离，不同个体因核心序列重复次数不同而产生DNA多态性。,17,真核生物基因组序列,18,一个家系的微卫星PCR检测结果,19,（三）单核苷酸多态性标记（single nucleotide polymorphism ,SNP） SNP与RFLP、STR等标记不同之处在于不以“长度”差别为检测手段，而是直接以序列的变异作为标记

8、。 基因组DNA某一特定的核苷酸位置上，可能发生单个碱基的变化，如转换、颠换等，使得群体中基因组的某些位点上存在差异。 SNP就是指基因组内特定的核苷酸位置上存在两种以上不同的核苷酸，其中最少一种在群体中的出现频率不少于1%（低于1%则视为突变）。,20,SNP是出现频率最高的标记，人类基因组中平均每1000 bp中就有1个SNP，总数可达300万个。 位于基因表达序列内的SNP可能会影响蛋白质的结构和表达水平，对分析基因与性状的关系有重要意义。 SNP是单碱基突变，任何用于单碱基突变的技术都可用于SNP检测，如RFLP、DNA序列分析、单链构象多态性（SSCP）等。最先进的是微数列矩阵DNA

9、芯片（DNA chip）技术。,21,三、分子遗传标记的应用 个体及亲缘关系的鉴定 DNA指纹 遗传资源的评估、监测、保护和利用 基因定位和遗传图谱的构建 标记辅助选择,22,第二节 基因组作图 一、基本概念 基因组作图主要分两个范畴：遗传作图（genetics mapping）和物理作图（physical mapping）。 作图需要界标（landmark）或遗传标记（genetics marker）。常用的遗传标记（血型、蛋白质多态型、等位基因、特定的DNA序列等）在早期构建遗传图时常用作制图的界标。现在主要采用以下的界标： 限制性片段长度多态性（RFLP） 微卫星DNA多态性界标 单核苷

10、酸多态性（SNP）界标 非多态的短单一序列作为界标,23,二、遗传图 （一）基本概念 应用遗传学技术构建能显示基因以及其它序列特征在基因组上位置的图。 方法是以多态的遗传标记作为界标，计算细胞减数分裂过程中遗传标记之间发生重组的频率，来确定两个遗传标记在染色体上的相对位置。 遗传标记之间的相对距离即图距以厘摩（cM，厘摩尔根，centi-Morgan）为单位。当两个遗传标记之间的重组值为1%时，图距即为1cM。,24,经典遗传图的作图最常用的是三点测交法。 现代遗传图的概念是于1980年提出的，就是将单纯的表型多态性界标改变为以DNA序列的多态作为作图界标。 各种遗传界标可在国际互联网上可以查

11、阅（http:/www.gdb.org）。 当用DNA序列多态作为界标的遗传图时，一但确定该DNA界标与某一基因的具体位置，便可分离克隆这个基因。 人类第一张以RFLP为界标的遗传图发表于1987年。,25,（二）遗传图的局限性 分辨率有限 高等真核生物子代数量有限，只有少数的减数分裂事件可供研究，连锁分析的分辨率受很大限制 人类基因组测序要求每100kb有一个标记，1996年发表的人类遗传图达到每0.6Mb一个标记（1Mb=1000kb） 精确度较低 假设交换是随机发生的，但由于交换热点的存在使某一区段的交换频率远高于其它区段，无法绘制精确的遗传图。,26,三、物理图 （一）基本概念 应用分

12、子生物学技术来直接分析DNA分子，从而构建能显示包括基因在内的序列特征的位置图。 以特定的DNA序列为界标直接排列在基因组DNA分子上，这些特定的DNA序列可以是多态的（如RFLP），但主要是非多态的（如STS、STR、EST）和特定的基因序列等。 物理图中界标之间的距离单位依作图方法而定，辐射育种作图单位为厘镭（cR），限制性作图单位元以物理长度，即碱基对数目（bp、kb）来表示。,27,（二）作图的基本方法 1限制性作图将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置上。 限制性内切酶有型、型、型，型、型酶位点特殊性不强，型专一性很强。 6 bp识别序列的限制性内切酶适用于50 kb以下的DNA

13、分子作图。 限制性作图方法是：比较一个DNA分子被两种酶切割产生的两套片段。,28,图7-16 限制性内切酶,29,3序列标记位点（sequence tagged site, STS）作图通过PCR或分子杂交将小段DNA顺序定位在基因组的DNA区段中。是目前用于构建最为详尽的大基因组物理图的主流技术。 STS作图原理 STS是一段短的DNA序列（100500）bp，每个基因组只有一个拷贝。 当两个片段含有同一STS时，可确认这两个片段重叠。 两个不同的STS出现在同一片段的机会取决于它们在基因组中的位置，彼此接近，同时出现在同一片段的机会就大，反之则小。 两个标记间的图距根据分离频率来计算。,

14、30, STS 的种类 表达序列标记（expressed sequence tag, EST），是从cDNA克隆中获得的短序列。EST是获得基因序列的简捷方法。 简单序列长度多态性（SSLP，小卫星和微卫星）。 随机基因组序列，从克隆的基因组DNA中随机测序获得。,31,第三节 基因定位方法 动物有几十条染色体，有几万个基因，平均每条染色体有上千个基因。 确定基因在哪一条染色体的哪一个座位上就是基因定位。 将定位的基因标注在染色体上就可得到基因图（gene map） 基因定位与基因组作图和基因克隆关系密切：基因定位后可以作为一个界标；确定基因的位置后就可按图去分离克隆基因 不同生物的基因定位方

15、法不完全相同。 基因定位的方法随着遗传学的发展而进步。,32,一、质量性状的基因定位 质量性状从表型上可以明显区分为不同类型的性状。 （一）家系分析定位法 性连锁分析是最常用的方法。哺乳动物中只出现在雄性的性状，控制该性状的基因在Y染色体上。性状出现隔代交叉遗传、且雄性出现比例高于雌性，则控制该性状的基因在Y染色体上。 （二）遗传重组值定位法 摩尔根提出的方法，根据基因间的重组值与遗传距离成正比的原理，采用两点测交和三点测交的方法进行基因定位。,33,（三）体细胞杂交定位法 不同物种细胞融合后，杂种细胞会出现排除某一亲本染色体的现象，在人鼠杂种细胞常专一性地排除人的染色体。可以制备含一条（或少

16、数几条）人染色体的杂种细胞。 定位测验法 鉴别杂种细胞中保留了哪些人染色体，测定杂种细胞产生了哪些基因产物，经分析可将基因定位在哪一条染色体上。,34,（四）原位杂交定位 将待定位基因的特定DNA序列或该基因转录的RNA作为探针，在标记了放射性同位素或非放射性化学物质后，与变性后的染色体DNA杂交，该探针就会同染色体DNA与其互补的序列结合成为双链，通过放射自显影或显色技术，就可确定探针（即待定基因）在染色体上的位置。,35,二、数量性状的基因定位 数量性状由微效多基因控制的呈连续变异的性状。由于每个基因效应值都较小，无法阐明单个基因的行为和效应，只能当作一个整体来分析。同时，对控制数量性状的基因数目不能准确估计，不能用提供基因的实际位置和功能上的信息。 随着分子数量遗传学的发展，极大地深化了数量遗传学的理伦，提供了在DNA水平研究数量性状的先进技术。,36,