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1、ReviewFractionationofcellsandsubcellularparticleswithPercoll 综述 用Percoll介质分离血细胞和亚血细胞颗粒 常用的血细胞分类技术 1 组织化学或细胞化学染色 histochemicalorcytochemicstaining 2 电子显微镜技术 electronmicroscopy 3 流式细胞技术 flowcytometry 4 单克隆抗体技术 monoclonalantibody 5 免疫探针技术 immuneprobe 6 密度梯度离心 densitygradientcentrifugation 密度梯度离心 用一定的介质
2、在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度 将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部 中间或底层 通过重力或离心力场的作用使细胞分层 分离 离心力 离心时间和离子转子因介质和被分离物而已 介质 media 的要求 1 能产生密度梯度2 密度高时 粘度不高3 pH中性或易调为中性4 浓度大时渗透压不大5 对细胞无毒 梯度离心常用介质 蔗糖 Sucrose 主要的不足表现为 1 高渗透压 密度越高渗透压越大 易使被分离物在所在的梯度带因渗透压不适 而导致被分离物损伤 2 分子量过小 342 易使蔗糖渗入到细胞膜进入到细胞质 从而破坏细胞 3 高粘性盐 Salts 常用的有CsCl K tartrate和NaB
3、r 主要不足同蔗糖1 2 多聚蔗糖 Polysucrose 即所谓的Ficoll 分子量为400000左右 其主要特点为弥补了蔗糖的高渗透压 但也是密度越高 渗透压越大 最大的弊端是太过粘稠 为蔗糖的好几倍 不易脱糖 碘化物 Iodinatedcompounds 常用的有 Hypaque 泛影钠 Urografin 泛影葡胺 Metrizoate 甲泛影钠 等 混合介质 Mixedmedia 常用的有 Ficoll Paque Histopaque Histoprep Lymphoprep等 硅胶 Colloidalsilica 即所谓的percoll Ofallsubstancesteste
4、d nonecameclosertoprovidingallthedesiredcharacteristicsthancolloidalsilica Percoll理化特性 平均分子量6 106 渗透压 20mOsm 密度1 13g ml pH中性 生理盐水配制的percoll应用液等渗 平均直径10 30nm 硅胶经处理后 对细胞无毒性 注 硅溶胶对细胞有毒性 主要是在SiO2coated一层聚乙烯吡咯烷酮 polyvinylpyrrolidone PVP A 0 15MNaCl 35nm B 0 25MSucrose 30nm Percoll的使用 市售原液1 100 percoll原液使
5、用时percoll原液 10 生理盐水 9 1配制成percoll应用液 再用生理盐水将percoll应用液调制成各个梯度 2 已经用10 生理盐水配制好的percoll应用液使用时只需用生理盐水将percoll应用液调制成各个梯度即可 梯度设置1 Stepgradients 不连续梯度 2 Continuousgradient 连续梯度 1 高速离心 2 梯度混合器 样品的放置1 与percoll液混匀2 置于梯度顶层3 置于梯度底层需用较大的离心力样品的收集 Percoll在贝类血细胞分选上的应用 SeparationofEuropeanflatoyster Ostreaedulis ha
6、emocytesbydensitygradientcentrifugationandSDS PAGEcharacterisationofseparatedhaemocytesub populations QingGangXue RenaultTristanFish ShellfishImmunology 2000 10 155 165 血细胞样品处理上Percoll梯度 10 30 50 和70 结果 10 30 界面处形成一带 P1 50 70 界面处也形成一带 G 上Ficoll梯度 5 10 15 和20 结果 5 10 界面处形成一带 F1 10 15 界面处也形成一带 F2 血细胞染色SDS Page P1 G F1Largehyalinocyte F2Smallhyalinocyte 欢迎大家批评和指正
