蛋白质测定-医学资料

《蛋白质测定-医学资料》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋白质测定-医学资料（57页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、 蛋白质和氨基酸的测定 1 概述 2 凯氏定氮法 3 氨基酸氮的测定 教学目标 了解蛋白质区别于其他有机化合物的主要 标志；掌握凯氏定氮法、双缩脲法、茚三酮 比色法、氨基态氮的测定方法及原理。 重点掌握：蛋白质系数的概念；凯氏定氮 中各种试剂的用途；凯氏定氮装置的原理及 操作技能；掌握PH计甲醛滴定法测定氨基态 氮的原理、方法及其操作技能。 教学内容（重点及难点） 1、凯氏定氮法（蛋白质系数，氮与蛋白质 之间的关系，各种试剂的用途，各种步骤的 目的及注意事项） 2、氨基态氮的测定（甲醛固定氨基的作用 ；不同PH值指示的滴定意义） 第一节 概述 蛋白质是生命的物质基础，也是食 品中重要的营养指标

2、。 食品中的蛋白质种类非常复杂，蛋 白质分子量的变化范围通常为5000 1000,000道尔顿，它们包括氢、 碳、 氮、氧和硫等元素。 l测定原理 l食物中碳水化合物、脂肪中只含有C、H 、O，不含有氮，含氮是蛋白质区别于其含氮是蛋白质区别于其 他有机化合物的主要标志，他有机化合物的主要标志，是存在于蛋 白质中最为特征的元素。 蛋白质由氨基酸以不同比例构成 ；氨基酸由C、H、O、N以不同 方法构成； 由于氨基酸种类不同和蛋白质中 氨基酸构成比例不同导致蛋白质 的含氮量不同 不同食品中蛋白质的含氮量 为13.4%19.1% 因此，因此，一般蛋白质含氮量为一般蛋白质含氮量为 16%16%， 1 1

3、份氮相当于份氮相当于6.256.25份蛋白份蛋白 质，此数值（质，此数值（6.256.25）称为蛋白质）称为蛋白质 系数，是一个平均值。系数，是一个平均值。 *蛋白质系数 16% 有一前提： 这些氮元素都是指的是蛋白质 里的氮元素，因此，当这些氮 元素来源于氮元素含量极高的 三聚氰胺时，是无法用蛋白质 系数返算为产品中蛋白含量的 。 食品中的总有机氮主要来自于蛋白 质，小部分来自于非蛋白质组份的 有机氮，会干扰蛋白质的测定。 食品中脂类和碳水化合物可能会干 扰 一些具有相似的物化性质的组份干 扰分析。 干扰蛋白分析物质: 凯氏定氮法包括有： 常量法、微量法、 经改进后的改良凯氏定氮法 这三种方

4、法的不同之处在于： 仪器、装置、试剂等都有了改进 二、凯氏定氮法 凯氏定氮法测定的是粗蛋白的含量 因样品中常含有核酸、生物碱 、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等 作蛋白质的含氮化合物，故凯氏定 氮法通常将测定结果称为粗蛋白质 含量。 2.1.2 凯氏定氮过程步骤： 样品制备(自学) 消化 蒸馏 吸收与滴定 *学习中特别需要注意掌握各个过 程中所使用的试剂都有哪些作用 2.1常量凯氏定氮法 1. 原理 消化： 样品与浓硫酸和催化剂 一同加热，使蛋白质分解，其中碳和 氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样 品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成 硫酸铵。 碱化蒸馏：然后加碱蒸馏，使氨蒸出。 吸收与滴定： 用H3B

5、O3吸收后生成硼酸氨； 再以标准HCl溶液滴定； 根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的 含量。 2.1.2.2 湿法消化 蛋白质中的氮形成铵离子和硫酸结 合成硫酸铵， 硫酸氧化有机物使碳元素和氧元素 被转化成二氧化碳和水。 样品中的有机物消化至透明澄清. 加硫酸作用： l浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水 并炭化为碳、氢、氮。 l 浓硫酸又有氧化性，使炭化后的 碳氧化为二氧化碳，硫酸则被还原 成二氧化硫 加入量不能太大：否则消化体系温 度过高，生成的铵盐发生热分解放出氨 而造成损失。 也可以加入硫酸钠、氯化钾提高沸 点，效果较差 硫酸钾：增温剂，提高溶液沸点 加速蛋白质的分解，缩短消化时间， 加入催

6、化剂： 加硫酸铜作用： 加速有机物的氧化与分解 有机物全部被消化完后，不再有硫酸亚 铜褐色生成，溶液呈现清澈的二价铜的篮 绿色，可指示消化终点的到达 2.1.2.3 碱化、蒸馏 消化完全的样品溶液中加 入浓氢氧化钠使溶液呈碱性 ，加热蒸馏，释放出氨气 2.1.2.4 吸收与滴定 4%硼酸吸收； 盐酸标准溶液滴定； 指示剂为混合指示剂（甲基红 溴甲基酚绿混合指示剂）。 甲基红溴甲基酚绿混合指示剂 终点判断： 指示剂在反应过程中色泽变化: （酸性条件下为甲基红所显的红色， 当体系变为绿色时则呈现溴甲基酚绿所有 的绿色，因此，称为混合指示剂） 指示剂先加入硼酸中，呈现酸性红色，通 入氨气后呈现变蓝绿

7、色；用HCL一滴定， 到后来又显了稍过量盐酸的酸性红色 定 氮 装 置 一 、 1、电炉 ； 2、水蒸气 发生器；3、 螺旋夹a；4 、小漏斗及 棒状玻璃塞 （样品入口 处）；5、反 应室；6、反 应室外层；7 、橡皮管及 螺旋夹b；8 、冷凝管9、 蒸馏液接收 瓶。 定氮装置二 2.1.3定氮装置的检查与洗涤 检查微量定氮装置是否装好。在蒸气发 生瓶内装水约三分之二，加甲基红指示剂 数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加 入数粒玻璃珠（或沸石）以防止暴沸。 测定前定氮装置如下法洗涤23次：从样 品进口入加水适量（约占反应管三分之一 体积）通入蒸汽煮沸，产生的蒸汽冲洗冷 凝管，数分钟后关闭夹子a

8、，使反应管中的 废液倒吸流到反应室外层，打开夹子b由橡 皮管排出，如此数次，即可使用。 本实验的定量以氮原子的去向 为准 一开始是蛋白-氨气-硼酸胺 所以必须关注这三种物质不能在检测过程中 的损失，无论在消化还是吸收或是滴定过程 中，都要保证其不损失 2.1.4 计算 新鲜食品中的含氮化合物大多以蛋白 质为主体，先测定总氮量，然后乘以 蛋白质换算系数，得到蛋白质含量。 换算系数一般为6.25（100/16 = 6.25）。 即：%N 6.25 = %蛋白质 2.1.5消化过程操作注意事项： 消化时不用强火，保持和缓沸腾， 以免黏附在凯氏瓶内壁上的含氮化合物 在无硫酸存在的情况下未消化完全而造

9、成氮损失。 消化过程中应不时转动凯氏烧瓶， 利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣 洗下，促进其消化完全。 问题1:为什么凯氏定氮所用 试剂溶液应用无氨蒸馏水配制, 如何配制。 问题二：加硫酸铜作用 l 起催化剂的作用。 l 还可指示消化终点的到达，为清 澈的蓝绿色。 l 指示蒸馏时的碱加入量是否足够 。 问题三：消化过程中是否有大量的泡 冲到瓶颈，原因是什么，如何解决？ 样品中若含脂肪或糖较多 开始消化时应用小火加热，并时 时摇动；或者加入少量辛醇或液体 石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控 制热源强度。 消化至呈透明后，继续消化30分 钟即可，含有特别难以氨化的氮化 合物的样品，需适当延长消化时间

10、。 有机物如分解完全，消化液呈蓝 色或浅绿色，但含铁量多时，呈较 深绿色。 问题四：如何判断消化的终点？ 问题五：蒸馏前若加碱量不足会 出现什么现象，为什么，如何解决 ？ 若加碱量充足，消化液变为深蓝 色，或产生黑色氢氧化铜沉淀，若 加碱量不足，则消化液呈蓝色而无 沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量 。 l 蒸馏完毕 先将冷凝管下 端提离液面清洗管口 再蒸1 分钟，用表面皿接几滴馏出液 ，以奈氏试剂检查如无红棕 色物生成，表示蒸馏完毕，即 可停止加热。 （避免吸收液倒吸） 问题六：蒸馏完毕拆下装置时的注意事项 不能超过40，否则对氨 的吸收作用减弱而造成损失 ，可置于冷水浴中使用。 问题七：为何要

11、控制硼酸吸收液 的温度？ 问题八：混合指示剂颜色： 在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液 中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。 问题九：硫酸与盐酸滴定的区别 l注意：H2SO4 与 HCL的区别 l1/2（H2SO4）= HCL 优点：1可用于所有食品的蛋白质分析。 2操作比较简单。 3实验费用低。 4结果准确，是一种测定蛋白质的经典方法。 5用微量法可测定样品中微量的蛋白质。 缺点 1最终测定的是总氮含量，而不只是蛋白质氮。 2实验时间太长。 3所用试剂有腐蚀性。 本实验方法的优、缺点 2.2 微量凯氏定氮法 1、原理及适用范围同前 2、与常量法不同点： 加入硼酸量有50 ml 10 ml, 滴定用盐酸

12、浓度由0.1 mol/L 0.01 mol/L , 可用微量滴定管。 2.3常量改良凯氏定氮法 2.3.1 原理及适用范围同前 在凯氏法改良中主要的问题是： 氮的完全氮化、缩短时间、简化 操作 这里主要需解决的是催化剂的种 类、硫酸和盐类的添加量等。 2.3.2 特点： （1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏 消化瓶，红外线加热的消化炉。 （2）快速：一次可同时消化8个样品， 30分钟可消化完毕。 （3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收 和滴定，自动数字显示装置。可计算总 氮百分含量并记录，12分钟完成1个样 。 为什么在蒸汽发生瓶中要加入指示剂甲基橙和硫酸？ 加入数粒玻璃珠的作用是什么？ 凯氏定氮瓶

13、的结构 对于定氮操作：内层加消化液、加碱液是反 应发生器。 外层加无氨蒸馏水、加热产生蒸汽-蒸汽从 内外两层连接小口处通入，对反应液进行水 蒸气蒸馏。还有一部分是氨气冷凝装置。 对于定氮瓶清洗操作：倒吸-需有压力差（内 层压力应大，外层压力应小才能产生倒吸）- 由于本实验装置中无产生压力装置，是利用了 大气压力，和冷却水快速流过细玻璃管所产生 的负压之间的压差-找寻大气压力入口，找寻 负压产生入口及负压的封闭系统 三、双缩脲法 原理： 碱性条件下，铜离子和多肽（至少 有二个肽键，如多肽和所有的蛋白质） 生成的复合物呈紫红色，吸收波长为 560nm，比色所得的吸光度值和样品中 蛋白质的含量成正比

14、。 样品的测定： 自学 氨基酸态 氮的测定 双指示剂甲醛 滴定法 电位滴定法 四、氨基酸态氮的测定 4.1 双指示剂甲醛滴定法原理： 氨基酸具有酸性的-COOH基和碱性 的-NH2基。它们相互租用而使氨基酸成 为中性的内盐。 当加入甲醛溶液时，-NH2基与甲醛结 合，从而使其碱性消失。 这样就可以用强碱标准溶液来滴定 -COOH基，并用间接的方法测定氨基酸 的总量。 吸取含氨基酸约20mg的样品溶液于 100ml容量瓶中，加水至标线，混匀后吸取 20.0ml置于200ml烧杯中，加水60ml，开动 磁力搅拌器，用0.05mol/l氢氧化钠标准溶 液滴定至酸度计指示pH8.2，记录消耗氢氧 化钠

15、标准溶液ml数（V10），供计算总酸含 量。 加入10.0ml甲醛溶液，混匀。再用上 述氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH9.2，记 录消耗氢氧化钠标准溶液体积。 而真正样品中强碱标准溶液滴定 -COOH基的过程是指: PH=8.2-9.2 此法准确快速，适用于测定食品中游离 氨基酸。 固体样品应先进行粉碎，准确称样后用 水萃取，然后测定萃取液；液体试样如酱 油、饮料等可直接吸取试样进行测定。 但不适合颜色较深或浑浊的样品测定。 说明及注意事项 4.2 电位滴定法原理： 根据氨基酸的两性作用，加入甲醛 以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸 性，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极 同时插入被测液中构成电池，用氢氧 化钠标准溶液滴定，依据酸度计指示 的pH值判断和控制滴定终点。 五、茚三酮比色法 原理 氨基酸（酰氨键）在碱性溶液中能与 茚三酮作用，生成蓝紫色化合物（除脯氨 酸