《抗原与抗体的相互作用及免疫学检测-医学资料》由会员分享,可在线阅读,更多相关《抗原与抗体的相互作用及免疫学检测-医学资料(38页珍藏版)》请在金锄头文库上搜索。
1、第七章 抗原与抗体的相 互作用及免疫学检测 n体液免疫的基础是抗原和抗体分子的结合 ,这种结合可以是游离形式的,也可以结 合在细胞表面。 n通过抗原抗体的结合继发出各种生理效应 ,如:溶细胞效应、促吞噬作用、凝集作 用、沉淀作用、调节作用等,形成一整套 机体体液免疫功能。 n抗原决定簇与抗体结合部位的结合,要求 分子结构有互补性,也因此具有高度的特 异性。 第一节 抗原与抗体反应的特点 一、特异性 抗原与抗体相互结合只局限于一些大分子表 面的特定部位,即抗原决定簇和抗体结合位点之 间,且以亲和力的作用方式结合在一起。抗原抗 体的结合并没有共价键形成,而是由这些特定部 位之间的短程分子力相互作用
2、的结果。这些吸引 力只有在极短的距离内才有效。因此抗原决定簇 与抗体结合位点在空间上必须处于紧密接触状态 ,才能产生足够的结合力。这种分子间的互补结 构决定了抗原抗体结合的专一性。 n抗原抗体分子间的作用力,即亲和力包括 以下几种: 1、盐键(离子键) 2、范德华力 3、疏水作用 4、氢键 二、抗原与抗体结合的可逆性 抗原抗体的结合反应是一个可逆的反应 Ab+Ag Ab:Ag 由于抗原抗体结合的可逆性,可利用 亲和层析法分离纯化抗原或抗体;利用待 测抗原和标准抗原与抗体的竞争结合,进 行抗原或抗体的定量测定,如放免检测法 、酶联免疫吸附法等 三、抗原与抗体反应中量的关系 当抗体与抗原结合时,如
3、果是颗粒抗原 ,则出现凝集现象;如果是可溶性抗原, 则产生沉淀作用。这些可见现象的出现是 以抗原与抗体反应特异性和亲和力为基础 的,同时也是抗原抗体反应的继发过程。 当抗原与同型抗体相遇时,在合适条 件下,不论彼此量的多少,都立即发生特 异性的结合形成抗原抗体复合物,这一过 程通常只需要几秒的时间便可完成,称为 反应的一级阶段。 在一级阶段之后,继发出现抗原与抗体 间进一步交联而形成网络状凝集物,进而 出现可见的凝集和沉淀,称为反应的二级 阶段。这一阶段是抗原抗体网格生长的阶 段,速率要慢的多,且在很大程度上依赖 于温度、离子强度等外界条件,但更重要 的是需要合适的抗原抗体分子比例。只有 当二
4、者的结合价彼此饱和时,才能连接成 一个大网格样凝集物,出现凝集或沉淀。 抗原抗体凝集(沉淀)反应形成的特点: 1、抗原结合价必须在2价以上; 2、抗体结合价也必须是2价或2价以上; 3、抗原抗体能形成复合物但不一定能形成沉淀; 4、抗原抗体结合形成大分子凝集物的前提是要求 其结合价彼此饱和; 5、当抗原大大过量时,只有溶解状态的抗原抗体 复合物,而无沉淀出现,在免疫检测中称为前 带现象。 第二节 抗血清的制备和抗体的纯化 抗体产生的特异免疫应答是指机体受外源物质 刺激后,产生体液免疫和细胞免疫的过程。在这一免 疫应答过程中,除依赖于抗原物质有特定的化学结构 外,还依赖于动物机体的免疫应答能力。
5、机体免疫应 答能力又受遗传因素的控制及机体的生理状况、抗原 物质进入机体的途径和佐剂的使用等因素的影响。 由于动物的遗传性不同,同一抗原对不同种动 物、同种不同品系甚至不同个体,产生免疫应答的强 弱是不同的。因此,在进行动物免疫时,必须选择对 该抗原敏感的动物,而且必须是年轻的、健康的。常 用的动物有马、羊、兔、鼠和豚鼠。 当抗原初次进入具有应答能力的动物体 内后,经过一段较长的潜伏期才出现抗体,又 经过一段高峰期后,抗体量逐渐下降直至消失 。这段时间总的抗体量是较低的,主要成分是 IgM,此为机体对抗原的初次反应。但当抗原再 次进入该机体时,血清中抗体很快出现,含量 也远高于初次反应,其抗体
6、成分主要是IgG,此 为再次反应。 佐剂在抗血清制备中的作用: 由于佐剂有吸附和包埋抗原的“储藏所 ”作用,延长了抗原在体内的存留时间,便 于抗原较长时间的、不间断的刺激机体免 疫系统,使初次反应与再次反应结合在一 起,其免疫效果更为理想。另外,在佐剂 中含有激活巨噬细胞等生理功能的卡介苗 类物质,可提高抗原的免疫原性,因此要 获得高效价的抗血清,常使用各种类型的 佐剂。 动物个体的不同组织部位对抗原刺激 的敏感性也是不同的。淋巴结、脾脏、足 掌、眼睑结膜等是反应敏感部位,也是免 疫动物的常用部位。 一、动物的免疫 1、抗原用量:0.5mg/kg 2、佐剂:弗氏佐剂 弗氏佐剂的成分和使用 3、
7、免疫方法:淋巴结注射、腹部皮下注射、 四足掌皮内注射。 4、免疫次数:每隔7-10天免疫一次,共需3- 4次。第二次免疫后开始测效价。 二、抗血清制备和抗体效价测定 1、采血方法:兔颈动脉放血、兔心脏取血、兔耳缘 静脉放血、鼠心脏取血、剪尾采血、眼窝采血。 2、抗血清制备:血液室温放置1-2h或冰箱内4度过 夜,血清便可充分析出,用滴管吸出或离心分离 取得。分离好的血清加入0.02%叠氮化钠,在4度 冰箱内保存可长达半年。 3、效价测定:用免疫动物时的抗原浓度作抗体效价 测定的抗原浓度。以出现沉淀反应的抗血清的最 大稀释倍数来表示抗血清的效价。 三、免疫球蛋白的纯化 由于抗原抗体的结合具有高度
8、的特异 性,在免疫检测中常常直接运用抗血清进 行,而无需对抗体进行纯化。 随着免疫检测技术的发展,如用铁蛋 白、胶体金等标记抗体作免疫电镜观测, 用荧光素、酶、同位素标记抗体作组织细 胞染色,或对抗原进行定量测定,就必须 对抗体进行纯化,但这类的纯化多数是类 别的纯化。 n抗体纯化的方法: 1、硫铵盐析法:简便、蛋白质变性较少, 33%饱和度的硫铵可以沉淀所有各类免疫球 蛋白;缺点是分离的纯度较差,对IgA类抗 体来说,浓盐可使其形成二聚体,不宜采 用。 2、Cohn冷酒精沉淀法: nIgA相对分子量160000,IgM相对分子量 1000000,故可通过分子筛将两者分开而得 到纯品。 3、硫
9、铵盐析和DEAE-纤维素柱层析法纯化IgG 在pH7.5的溶液中IgG带正电,其他血清 蛋白带负电,因此阴离子交换剂DEAE-纤维 素可以一次将IgG提纯到很高的纯度 4、IgM的纯化方法:18%饱和度硫铵沉淀 +DEAE-纤维素柱层析法。 第三节 抗原与抗体反应-免疫检测法 抗原与抗体结合后,只有出现可见的反 应,如凝集、溶血、沉淀实验等,或用荧光 素、酶、放射性同位素等标记方法提高可测 性,才便于在免疫检测中运用。可见性反应 的出现,对抗原抗体分子合适比例的要求远 比对彼此绝对量方面要高得多。这就是说, 一方面在进行免疫检测时要注意抗原抗体的 用量;另一方面只要提高可见度或可测性, 便可大
10、大提高免疫检测方法的灵敏度。 一、凝集反应 凝集反应是指颗粒抗原与相应抗体结合 反应出现的可见性现象。颗粒抗原如完整 的细菌、红细胞等与相应抗体相混合,在 一定条件下出现凝集。凝集反应中抗原称 为凝集原,抗体称为凝集素。 二、沉淀反应 当抗原是可溶性分子时,与抗体结合则形成沉淀。 1、絮状沉淀反应 一系列试管中加入等量的抗体和递增量的抗原,在 中性条件下37度保温1-2h,便可见到絮状的蛋白质沉淀 。可用于寻找抗原抗体反应的合适比例,检测抗原抗体 的分子比。 2、环状沉淀反应 在试管中加入抗体后,小心加入相应抗原,使抗原 抗体步混合,37度保温10-20min,在二者界面上出现环 状沉淀。不能
11、用于定量测定。 3、双向扩散:又称琼脂扩散,是利用琼脂凝胶 作介质的一种沉淀反应。 琼脂是多孔的网状结构,可使大分子物 质通过,分子的扩散作用使分别两处的抗原抗 体相遇,比例合适时形成沉淀。可观测到沉淀 弧。 沉淀弧的特征与位置取决于抗原分子的 大小、结构、扩散系数和浓度等。当抗原、抗 体存在多种体系时,会出现多条沉淀弧。 双向扩散法的操作:生理盐水配制1%-5%的琼 脂,取4mL倒在显微镜用的载玻片上,凝固 后打孔,中心孔滴入抗原,外周孔滴入抗 体用于测定抗体效价,中心孔滴入抗体, 外周孔滴入抗原,用于检测抗原的存在和 定性抗原。 抗原抗体为单一体系时,抗原浓度不 同,沉淀弧的特征不同: 抗
12、原抗体为多体系时,出现的沉淀弧有 多条,彼此互不干扰。 4、单向免疫扩散:又称单向琼脂扩散,是定 量抗原的一种检测方法。与双向扩散不同的 是在琼脂中含有一定量的抗体,孔内加入未 知量的相应抗原。在37度保温过程中,孔内 的抗原向周围扩散,与抗体形成沉淀圈。根 据沉淀圈的大小确定抗原的含量 另外还有其他众多的免疫检测技术 和手段,其机理都利用了抗原抗体的 沉淀反应。例如微量免疫电泳、对流 免疫电泳、火箭电泳等。只不过其检 测的对象和检测的目的各有不同。 三、补体结合试验 当抗体与细菌、红细胞等颗粒抗原结 合并形成抗原抗体复合物后,可结合补体 引起溶菌、溶血效应。用补体结合试验既 可以测知患者血清
13、中补体的总量,也可以 检测未知抗原或抗体的量。 测定人血清补体总量的方法是以绵羊 红血球的溶血为指示。当绵羊红血球与抗 绵羊红血球结合后,加患者血清,观测溶 血程度。 用于测定未知抗原/抗体时,采用两套系 统,一套是待测的抗原抗体系统,称为检测系 统,一套是包括绵羊红血球和抗绵羊红血球抗 体的指示系统。待测系统中有无待测得抗原/ 抗体是利用指示系统中是否出现溶血来判断。 反应的过程是首先加待测得抗原/抗体, 反应一段时间后加入补体,在反应一段时间后 加指示系统。有待测抗原抗体结合时,必然结 合补体,不会出现溶血,没有待测物质时出现 溶血。 四、荧光抗体技术 免疫荧光法是将荧光素与特异性血清 抗
14、体以化学方式结合起来,然后将此荧光 标记了的抗体作为一种试剂在特定条件下 浸染标本,使与标本中相应的抗原产生结 合反应,再在荧光显微镜下,以紫外光为 光源进行观察。当出现荧光时,表明标记 抗体存在,相应的抗原也存在。 免疫荧光法有直接法和间接法两种。 第四节 免疫亲和层析 生物高分子具有能和某种相对应的专一分子 可逆结合的特性,例如酶的活性中心或别构中心 能和专一的底物、抑制剂、辅助因子效应剂通过 某些次级键相结合,并在一定条件下又可以解离 。抗体与抗原,激素及其受体,核糖核酸与其互 补的脱氧核糖核酸等体系,都具有类似的特性。 这种高分子和配基之间形成专一的可解离的复合 物的能力称为亲和力。根据这种具有亲和力的生 物分子间可逆的结合和解离的原理发展起来的层 析就称为亲和层析。 亲和层析法的基本过程: 1、偶联:将欲分离的高分子物质的配基在不影响其生 物功能的情况下与水不相溶性的载体结合,制成亲和 吸附剂或免疫吸附剂。 2、装柱:在层析柱内装入固相化的配基 3、亲和层析:含有高分子物质的混合液在有利于配基 和高分子之间形成复合物的条件下进入装有亲和吸附 剂的层析柱。高分子物质结合留在柱内,其他杂质流 出。 4、洗脱:改变条件,促使配基和高分子物质分离而释 放出需要的物质。 5、再生:将亲和层析柱的充分洗涤再生,用于下一周 期的纯化工作。