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1、 1. 打开一张图片 在默认的intensity格式中，是图片灰度， 越黑数值越小，越白数值越大。而实际上 我们测量的染色强度是光密度，染色越深 ，光密度值越大。 如果不进行光密度单位的转换，测量的数 值将完全是错误的。 转换光密度单位的方法如下: 点击:measure-carliberation-intensity，调出intensity校 正窗口。 然后在窗口中点new按纽，再点一下下面的std optical density选项，这时可以看到窗口中的直线变成了反向的 曲线。 然后还要点一下最上面的system按纽。 最后点close关闭窗口。 这样就把程序系统的灰度单位转换成了光密度单位
2、。 关于光密度较正的详细内容请参见第十帖及第十一帖。 校正光密度单位的操作要在打开第一张图片后立即进行 。将光密度单位设定为system之后就不必再对后面的每 一张照片都进行光密度校正了。 2. 点击measure- count/size 图 1 3.在窗口中选中manual,再点击select color,弹出颜色选择窗口segmentation 图 2 4. 点一下吸管图标，在目标区域点一下， 就可以选中该点的颜色，当然一下是不可 能完全选中所需要指定的全部区域，可以 在未选中的地方接着再点，这样多次选取 ，直到把想选中的区域全部选中为止。 5 图3中被标上红色的区域被定义为一个 clas
3、s,其中每一个独立的小区块被定义为 这个class中的一个object。以此图为例， 图中深蓝色的部分是细胞核，因此所有的 细胞核都被选中成一个class，其中每一个 细胞核就是一个object。 用红框圈起来的四个工具按纽分别是:吸管、撒消上一步操作、 橡皮擦、全部清除。下在的小方框里则是吸管位置的选取颜色。 图 3 选取完AOI后，点击close回到count/size窗口，下一步就 可以对选中的object进行测量操作了。如图4所示。 点击count/size窗口中的measure菜单，点select measure，这是选择要进行何种测量操作，在弹出的测 量选择窗口左侧列出了各种可用的
4、测量选项，最常用的 测量有: area面积 density(mean)平均光密度 diameter直径 IOD(integrated optical density)累积光密度 在相应的项目上点一下，该测量项目就被选到中间的窗 口中了，同时关于该测量的详细说明会显示在最右边。 如果想取消某个已选中的测量项目，则在左边窗口中该 项目上再点击一下就可以了。 图 4 选好了待测量的区域，也指定了测量项目，就可 以进行测量统计了，点击一下测量选择窗口的 OK纽，关闭这个窗口，就回到了count/size窗口 ，再点击一下count按纽，就可以看到程序在进 行测量，稍等几秒钟即可读取测量数据.如图5 分
5、别点击count/size窗口中view菜单中的 measurement data和statistics，就分别弹出这 两个数据窗口。前者是这个calss中每一个object 的测量数据，后者是这些测量数据的统计参数， 如总数、平均值、累加、标准差等。本例中得到 的就是每个细胞核的面积、平均光密度值、直径 、累积光密度值。统计数据则可得到这张图片中 所有细胞核的平均面积、平均光密度值，平均直 径、累积光密度值，当然还有细胞核的数目，就 是所有object的数目。 图 5 9 测量数据转入EXCEL处理起来最方便。 只要在数据菜单中点file - DDE to EXCEL 。数据就传到EXCEL
6、的sheet1里去了。如 图6. 在这个示例图片的统计数据中samples为 图中所有细胞核的个数。 第一列为area,其中的Mean值为各个核的 平均面积，后面就是平均灰度、平均直径 ，这些是有意义的测量统计数值。但IOD 却是SUM值更有意义。 图 6 二、 irregular工具 这是一个用来描绘不规则孤立对象边界的工具 。图中一个个棕黄色形状是免疫组化染色的贴 壁培养细胞， 为了计算每个细胞的面积及蛋白表达，首先就 是要选取每个细胞的边界线。这就可以用到 irregular工具 了。在工具栏上点一下那个不规则园形的按纽 ，就调出了irregular工具条。 图 7 图8：这个工具的标题
7、叫Magic wand，就是 photoshop中的魔棒呀。将鼠标移至图中一个细 胞的中间，光标就变成魔棒了，在一个位置左键 点一下，就选中了这个位置及其周围灰度相似的 区域。这里相似的定量范围由Range的值来决 定。较大的值为较大的灰度范围，点一下能选中 一大片区域。较小的range值则为较小的灰度范 围。在一个区域上多点几下，就能选中这个区域 的整个边界了。最后点一下右键，就确定了一个 不规则形状的选定区域。 点一下左边的问号，就能看到相应的使用说明。 smooth值是用来平滑区域边界的。一般不需要 平滑，因此默认值为零。 图 8 选择多个区域（图9） 选中一个区域后如果还要在同一张图片
8、上再选另 一个区域，不能直接点选，要先点击一下工具栏 上的Multiple AOI按纽，再点击add，接下去就可 以到另一个选择区域点选。 选好一个新的区域后再回去点Multiple AOI-add 确认，再继续下一个，直到选取完所有的AOI。 最后在图片上任一处点一下右键结束选择操作。 结束后如果又想再增加选择区域，只要再点一下 newAOI按纽，就可以调出工具条继续增加选择 区域。 图9 这个irregular工具还有另一个操作方式， 在问号旁边有个trace按纽，点一下它，工 具条就变成另一个样子了。 这种操作方式是沿着孤立图像的边缘寻迹 ，从而画出一个沿着孤立形状边缘围成的 一个AOI
9、。 第一种是手画法。确认工具条右边的Auto 选项没有打勾，将光标移至目标图形处按 住左键拖出一个闭合图形，点右键结束。 用鼠标画当然是不会准确的。实在没别的 招了才会出此下策。 第二种方法是自动寻迹。图10所示 把那个Auto给选上，speed值给减到1(慢速看得清楚)， 在目标图形的边缘处左键点一下鼠标，然后沿着边缘稍 移动一下鼠标后再点击一下左键，这是给程序指明一个 寻迹的方向，马上就能看到光标自动沿着边界走起来了 ，一直会走到起点处才会停止。这样就自动围成了一个 闭合区域，点一下右键就确认了这个AOI。重复选取多 个AOI的方法与楼上一样。 如果目标图形边界清晰，那么这个工具是非常管用
10、的。 可惜的是在许多情况下边界是模糊不清的，光标走到此 处时会乱走一气。这时就要及时先点一下鼠标使光标暂 停下来，然后在期望的方向延长再点一下左键，给程序 指明一下前进的方向，如此多次，直到光标回到起点为 止。最后点一下右键围成一个闭合的AOI。围好的AOI边 界是绿色框。 图10 测量每个区域的几何尺寸及光密 度图11 点开count/size窗口，点菜单EDIT-convert AOI to Objects.这样就把刚才选中的一个个AOI变成 了要测量的object了，那些小区域的颜色也由 AOI绿色外框线变成了object的标记了。 object的标记类型是可以自己设定的。在 count
11、/size窗口右边有一个option按纽，点开它 就能设定object标记的外观了。在option窗口中 ，outline style可以选outline(轮廓线)或filled(填 充class颜色)。label style 可以选择为object序号 或测量值。再下面是label的文字颜色。 右上角还有一个class的颜色选择按纽。 图11 下一步是点measure菜单下的select measurements。选上要测量的项目。 注意，选完后要点击这个菜单中的 measure按纽(而不是count/size窗口中的 count按纽)。然后是OK按纽关闭measure 窗口，点开view菜单下的measurement date和statistics数据窗口。几个object的测 量数据就已经在里面了。 如果你还想继续增加objcet，可以直接用 irregular工具画AOI，然后点convert AOI to object。这期间把数据窗口留着不关闭 ，可以看到新增的object测量数据会立即 被更新 图12 segmentation工具 1 打开图片并调出count/size窗口 图13
