新基因工程的基本操作原理

《新基因工程的基本操作原理》由会员分享，可在线阅读，更多相关《新基因工程的基本操作原理（65页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、1.2 基因工程的基本操作程序 基因工程基本操作的四个步骤 1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定 一、目的基因的获取 1、目的基因主要是指_ 编码蛋白质的基因 请举出三个以上的例子 2、获取目的基因的常用方法有哪些? （1）从基因文库中获取 （2）利用PCR技术扩增 （3）人工合成 请阅读P9第一和二两段 目前被较广泛提取使用的目的基因有：苏云金 杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、 种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。 ( (一一) )从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不

2、同基因的许多 DNADNA片断，导入到片断，导入到受体菌的群体受体菌的群体中，各中，各 个受体菌分别含有这种生物的不同基因个受体菌分别含有这种生物的不同基因 ，称为基因文库，称为基因文库 基因文库 基因组文库 部分基因文库 （如:cDNA文库） 1.基因文库 基因组 文库与 部分基 因文库 的关系 DUCK179制作 基因文库的构建模式图基因文库的构建模式图 通过对 受体菌 的培养而 储存基因 DUCK179制作 2.基因组文库的构建方法 鸟枪法： 供体细胞中的DNA 许多DNA片段 运载体 限制酶 与载体连接 载入 受体细胞 产生特定性状 导入 目的基因 分离 (直接分离法) (一)从基因文

3、库中获取目的基因 反转录法： 以目的基因转录成 的信使RNA为模板，反 转录成互补的单链DNA ，然后在酶的作用下合 成双链DNA，从而获得 所需的基因。 目的基因的mRNA 单链DNA (互补DNA） 反转录酶 2.基因文库（cDNA)的构建方法 DNA聚合酶 双链DNA (目的基因) 基因组DNA文库 cDNA文库 基因组DNA文库与cDNA文库的比较 1、在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最 方便方法是 A、化学合成法 B、基因组文库法 C、cDNA文库法 D、聚合酶链反应 A 上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？ 优点缺点 鸟枪法 反转录法 根据已知氨基 酸合成DNA法 操作简便

4、 广泛使用 工作量大，盲目， 分离出来的有时并 非一个基因 专一性强 操作过程麻烦， mRNA很不稳定，要 求的技术条件较高 专一性最强 仅限于合成核苷酸 对较少的简单基因 思考:为什么要构建基因文库?直接从含有目的基因的生物 体内提取不行吗? 如何从基因文库中得到所需要的基因？如何从基因文库中得到所需要的基因？ 依据：目的基因的有关信息。 如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性。 DUCK179制作 1、构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的 A、染色体DNA B、线粒体DNA C、总mRNA D、tRNA 2、目的基因

5、可从基因文库中获得，下列有关基因文库 的描述正确的是 A、某生物的全套基因就是一个基因文库 B、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个 生物 体内，则这个生物就是一个基因文库 C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库 D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文 库 A C (二)利用PCR技术扩增目的基因 二利用二利用PCRPCR技术技术扩增目的基因扩增目的基因 n n PCR:PCR:聚合酶链式反应聚合酶链式反应 是一项 在生物体外复制特定DNA片段的核酸 合成技术 n n 前提条件是：要有前提条件是：要有一段已知目的一段已知目的 基因基因的核苷酸序列，以便根据这一的核

6、苷酸序列，以便根据这一 序列合成序列合成引物。引物。 DUCK179制作 PCR扩增仪 n 过程 变性、退火、延伸三步曲 变性：加热至9095 双链DNA解链成为单链 DNA 退火：冷却至5560 部分引物与模板的单链 DNA的特定互补部位相配 对和结合 延伸：加热至7075 以目的基因为模板，合 成互补的新DNA链 变性 退火 延伸 原理：原理：DNADNA双链复制双链复制 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术 条件：_、 _、_ 、 _.前提条件： 原理：_ 方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循 环的次数） 结果： 选修3 P10 聚合酶链式反应 体外特定DNA片段

7、DNA复制 模板DNA 四种脱氧核苷酸一对引物 DNA聚合酶 指数 2n 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增 (二)利用PCR技术扩增目的基因 过程： a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形成_ b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。 c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从 引物的5端3端延伸，合成与模板互补 的_。 氢键单链DNA 双链 DNA链 根据已知的氨基酸序列合成DNA法(人工合成） ： 根据已知蛋白质的 氨基酸序列，推测出相 应的信使RNA序列，然 后按照碱基互补配对原 则，推测出它的结构基 因的核

8、苷酸序列，再通 过化学方法，以单核苷 酸为原料合成目的基因 。 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列 推测 推测 目的基因 化学合成 目的基因的获取： 1、在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNA分 子片段为ATGTGTACAC，要使其数量增多，可用 PCR技术进行人工复制，复制时应给予的条件是 双链DNA分子为模板 ATGTG或TACAC模板链 四种脱氧核苷酸 四种核苷酸 DNA聚合酶 热 稳定DNA聚合酶引物 温度变化 恒温 A B C D D 2、在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧 核苷酸对，其中腺嘌呤脱氧核苷酸是460个）放入DNA 扩增仪中扩

9、增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱 氧核苷酸的个数是 A.540个 B.8100个 C.17280个D.7560个 B 3、目的基因主要是指_的结构基因。 获得目的基因的常见方法有三种：（1）从基因文库中 获取目的基因，根据基因的_序列，基因在 _上的位置，基因的_产物mRNA，基 因的_产物蛋白质等获取目的基因。（2）利用 PCR技术扩增目的基因，该技术是一项在_完 成的核酸合成技术，前提条件是有一段已知目的基因的 _序列，以便于合成_。（3）如果基 因较小且核苷酸序列已知，可以通过_方 法。 编码蛋白质 核苷酸 染色体 转录表达 体外 核苷酸引物 人工合成 4、下列获取目的基因的方法中

10、需要模板链的是 从基因文库中获取目的基因 利用PCR技术 扩增目的基因 反转录法 通过DNA合成仪利 用化学方法人工合成 A B C D D PCR技术扩增与DNA复制的比较 PCR技术DNA复制 相 同 点 原理 原料 条件 不 同 点 解旋 方式 场所 酶 结果 碱基互补配对 四种脱氧核苷酸 模板、能量、酶 高温下变性解旋 解旋酶催化 体外复制(PCR扩增仪内 ) 主要在细胞核内 热稳定的DNA聚合酶 （Taq酶） 大量的DNA片段形成整个DNA分子 解旋酶、 普通的DNA聚合酶 等 1.用一定的_切割 质粒，使其出现一个切 口，露出_。 2.用_切断目 的基因，使其产生_ _。 (二)基

11、因表达载体的构建 核心 3.将切下的目的基因片段插入质粒的_处， 再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒） 限制酶 黏性末端 同一种限制酶 的黏性末端 切口 DNA连接酶 相同 5.基因表达载体的组成： 复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因 二、基因表达载体的构建基因工程的核心 目的： 所需结构： 使目的基因在受体细胞中稳定存在， 并且可以遗传给下一代，同时使目的 基因能够表达和发挥作用。 它们各自 的作用是 什么? 目的基因+启动子+终止子+标记基因 n n 启动子：位于基因的首端的一段特殊启动子：位于基因的首端的一段特殊 的的DNADNA片断，它是片断，它是RNARNA

12、聚合酶识别和聚合酶识别和 结合的部位，有了它才能驱动基因转结合的部位，有了它才能驱动基因转 录出录出mRNAmRNA，最终获得蛋白质，最终获得蛋白质 RNA聚合酶 半乳糖苷酶 酶酶 RNA聚合酶 启动子 结构蛋白基因 RNA聚合酶 DUCK179制作 终止子终止子：位于基因的尾端的一段特位于基因的尾端的一段特 殊的殊的DNADNA片断，能终止片断，能终止mRNAmRNA的的 转录转录 标记基因的作用是为了鉴别受体细胞 中是否含有目的基因，从而将有目的 基因的细胞筛选出来 DUCK179制作 2、基因表达载体的作用 a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代 b、同时使目的基因能表达和发挥作

13、用 思考与探究1：作为基因工程表达载体，只需含有目 的基因就可以完成任务吗？为什么？ 不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用 ，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因 等。必须构建上述元件的主要理由是： （1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基 因的启动子才能比较有利于基因的表达； （2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将 编码序列导入受体生物中无法转录； （3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记； （4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些 其他调控元件，如增强子等； （5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什 么部

14、位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目 的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等 。 1、（多选）一个基因表达载体的构建应包括 A目的基因 B启动子 C终止子 D标记基因 ABCD 2、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是 A启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起 始密码 B启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对 mRNA的转录起调控作用 C标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因 从而便于筛选 D基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同 而有所差别 A 3、目前转基因工程可以 A. 打破地理隔离但不能突破生殖隔离 B. 打破生殖隔离但不能突破地理隔离 C. 完全突破地理隔离和生殖隔离 D. 部分突破地理隔离和生殖隔离 C (三)将目的基因导入受体细胞 转化 方法 将目的基因导入 植物细胞 将目的基因导入 动物细胞 将目的基因导入 微生物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 显微注射法 感受态细胞 目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程 受体细胞 稳定表达 常用的受体细胞：常用的受体细胞： 有