生物安全评估

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1、 病原微生物实验室风险评估 王国治 中国药品生物制品检定所 病原微生物实验室生物安全风险管理是生物安 全的核心工作，病原微生物实验室的风险评估是建 立健全的风险管理体系的基础，规范的风险评估工 作应始于实验室设计建造之前，实时评估于实验活 动之中，定期阶段性再评估于使用之后。完善的风 险评估制度对于保证生物安全具有非常重要的意义 。 评估在是在基于微生物危害程度分类以及相关背景资料的 基础上，同时考虑实验室活动中可能涉及的暴露或潜在暴露因 素与意外事故、实验室设施设备、个人防护、废弃物处置、实 验室保安、人员素质、火灾、水灾等其他因素，通过对各因素 的风险识别与分析，提出降低风险的措施，评估采

2、取措施后的 残留风险，建立适时的再评估方案与制度。风险评估可帮助生 物安全实验室设计者与使用者确定实验室的规模、设施与合理 布局，帮助操作者正确选择生物安全水平(设备和操作)，制定 相应的操作程序、预防风险发生与可能发生风险后的方案与相 关管理规程，以便实验室在运行过程中可采取适宜安全防护措 施、减少危险性事件发生，将工作人员暴露的危险和使环境污 染降到最低限度。 病原微生物危害程度分类 危害程度分类是病原微生物危险评价的主要依据之一 ，危害类别的高低是根据病原微生物对个体和群体的感染后 可能产生的相对危害程度来划分的。由于病原微生物在不同 国家流行的状况不同，因此，不同国家根据病原微生物的传

3、 染性、感染后对个体或者群体的危害程度以及流行状态并考 虑是否具有有效的预防治疗措施等因素，来划分各自的微生 物危害程度分类。我国对病原微生物的危害分类标准除进行 危害程度分类外，还规定了其不同实验操作的防护水平以及 运输的包装要求，详见卫生部与农业部颁布的病原微生物名 录。 第二节 病原微生物背景信息与分析 通过病原微生物的相关背景资料与分析， 用于了解病原微生物或毒素的毒力、致病性、生物 稳定性、传播途径，病原微生物的传染性，病原微 生物的地方流行性，有效的疫苗和治疗及诊断方法 的可用性等信息，为进一步分析评价可能造成风险 以及危害程度，采取相关措施提供科学依据。病原 微生物背景信息至少应

4、包括以下内容： （一）病原微生物的生物学特性 1分类与起源 病原微生物的分类是从事微生物学工作的基础，人间传 染的病原微生物名录的危险等级和实验操作的生物安全实验 室等级是以病原微生物属或种确定。微生物的分类是根据微生 物的表型特征相似性或系统发育相关性进行分群归类，根据相 似性或相关性水平排列成系统，其分类单元分为七个基本的分 类等级，由上而下依次是：界、门、纲、目、科、属、种；病 毒除上述分类还应考虑其结构的大群划分：（双链）ds DNA ，有包膜；（双链）ds DNA，无包膜 ；(单链)ss DNA ，无包 膜；（双链）ds RNA，有包膜；（双链）ds RNA，无包膜； （单链）ss

5、RNA，有包膜；（单链）ss RNA，无包膜。同时 了解该病原微生物原始分离有关信息。 （一）病原微生物的生物学特性 2形态特征 了解病原微生物的形态结构有助于鉴定病原微生物以 及疾病的诊断，同时有助于评估操作病原微生物是否污 染、生长状况、毒力以及抵抗力。 病原微生物的形态结构与其在宿主体内外生长繁殖与生 物学特性相关，如炭疽杆菌是否有荚膜芽孢形成率的高 低与炭疽杆菌抵抗力、致病力和免疫性有关。对于细菌 应关注细胞的球菌、杆菌或螺旋菌的形状、大小、排列 、染色反应以及荚膜、鞭毛、菌毛、芽孢等。对于病毒 应关注形态属球状病毒、杆状病毒、砖形病毒、冠状病 毒、有包膜的球状病毒、具有球状头部的病毒

6、、封于包 含体内的昆虫病毒以及大小是否有囊膜等。 （一）病原微生物的生物学特性 3培养特性 病原微生物的分离或扩增培养是实验室最常见的实验活动 ，通过了解病原微生物的培养特性可直观根据其形态特征进 行初步鉴定，了解病原微生物对营养需求、生长繁殖速度以 及是否在实验过程发生了污染， 对细菌真菌可通过固体、半固体或液体培养基培养的菌 落形态，菌落形成时间；对碳源、氮源、营养类型的营养要 求；代谢产物的种类、产量、显色反应以及产酶种类、反应 特性、生理生化反应，了解分析不同菌种或菌株的差异。病 毒在实验动物、鸡胚或细胞培养中进行，以死亡、发病或病 变等作为病毒繁殖状态指标，或以血细胞凝集、抗原测定等

7、 作为间接指标，可采用空斑法测定病毒数量。 （一）病原微生物的生物学特性 4免疫学特性 不同类型病原微生物抗原存在差异，即使同一种病 原微生物其抗原也可能存在差异，利用其差异常用于亚 种以下的细分.当同种或同亚种内不同菌株之间的性状 差异不足以分为新的亚种时,可以细分为不同的型，通 过抗原存在差异的特性可作为病原微生物的免疫学鉴定 为实验室感染监测方法的选择提供必要的背景资料。 如大肠杆菌的抗原成分复杂，可分为菌体抗原（O） 、鞭毛抗原（H）和表面抗原（K），后者有抗机体吞 噬和抗补体的能力。根据菌体抗原的不同，可将大肠杆 菌分为150多型，其中有16个血清型为致病性大肠杆菌 ， （一）病原微

8、生物的生物学特性 5遗传特性 微生物的基因组的结构与功能的分子生物学特征是 鉴别病原微生物菌毒株型特异性的指征，对病原微生物 的鉴定、菌毒株变异、毒力与致病性、耐药性以及临床 检验具有重大意义，了解微生物的基因组的结构与功能 背景知识对生物安全实验室污染与人员感染分子生物学 监测方法以及对所操作的病原微生物的致病性与防护的 选择提供依据。 应根据病原微生物测序结果，收集具特征性的基因 及编码产物信息以及与遗传特性相关的传播能力与致病 力、对药物敏感性的分析等信息。 （一）病原微生物的生物学特性 6变异性 病原微生物可发生自发或在外因作用下发生碱 基的增加、缺失、变位、重组，使其在生物学特性 、

9、耐药性、免疫学特性发生变异，可导致病原微生 物毒力与致病力增强或减弱，了解病原微生物变异 规律与特征，将有利于跟踪微生物变异避免或规避 风险。 病原微生物变异应注意收集分析不同微生物的 遗传稳定性与发生突变的频率，以及理化因子对变 异的影响以及产生变异后病原微生物毒力与致病力 变化的趋势。 （一）病原微生物的生物学特性 7毒力 目前国内对病原微生物的危害分类是按病原微生物种 属进行分类，但同一种属不同菌毒株的毒力与致病力有差异 ，了解不同病原微生物的毒力可为选择适当防护方式提供依 据。 如从自然感染动物体内分离的狂犬病毒街毒株（野毒株 ），一般毒力较强。狂犬病毒的街毒株其特点是发病潜伏期 长，

10、易侵入脑组织和唾液腺，也易形成内基小体。而狂犬病 毒街毒株在兔脑内连续传代后获得的狂犬病毒减毒株（固定 毒株），对兔致病的潜伏期缩短为固定的46天，对人致病 力减弱，可用于制备疫苗。结核杆菌H37Ra弱毒株对人或动 物致病力极低， H37Rv为实验室常用菌株在实验室多传代 毒力明显降低、临床分离敏的感菌、耐药菌、多耐药菌、广 泛性耐药菌等菌株对动物均有较强的致病力，对动物毒力基 本一致，但对不同耐药类型菌株感染临床治疗效果不一样。 （二）在环境中的稳定性 病原微生物的稳定性是指其抵抗外界环境 的存活能力。病原微生物为了维持其种系的 生存，可凭借其自身的结构特点以应对外界 不利的环境。通过了解病

11、原微生物在自然环 境中的稳定性，可对实验室发生泄露后安全 性评估提供参考依据。 1.在自然环境中的存活能力与适应能力： 2与其它生物和环境的交互作用 （二）在环境中的稳定性 1.在自然环境中的存活能力与适应能力： （1）在自然环境中的存活能力与适应能力：自然环境 中的存活能力：不同的微生物的稳定性不同，如，被炭 疽杆菌芽孢污染的草原，其传染性可保持数十年。甲型 肝炎病毒较一般病毒抵抗力强，对酸、碱稳定，对热有 较强的耐受力，在自然界不易失活，常易造成流行。而 HIV病毒离体后迅速死亡。 （2）对日光与紫外线敏感性：直射日光有强烈的杀菌 作用，是天然的杀菌因素。日光的杀菌效力因地、因时 及微生物

12、所处环境不同而异 。多数微生物在直射日光 的照射下，半小时到数小时即可死亡。芽胞对日光照射 的抵抗力比繁殖体大得多，往往需经20h才死亡。结核 杆菌的对外界环境抵抗力则较强，在室内阴暗潮湿处能 存活半年，在干痰中存活68个月，若粘附于尘埃上， 保持传染性810d，但在阳光直接照射下2h死亡， （二）在环境中的稳定性 1.在自然环境中的存活能力与适应能力： （3）对温度的敏感性：温度对微生物生生存非常重要 的因素。每种微生物都有其生长繁殖的温度范围，当温 度低于或高于微生物所能忍耐的温度界限时，会停止生 长或导致死亡。大多数微生物对低温具有很强的抵抗力 。低温下，代谢活动降低到最低水平，生长繁殖

13、停止， 但仍可长时间保持活力，嗜冷菌喜欢在寒冷条件下生长 ，而淋球菌、脑膜炎球菌及流行性感冒杆菌在低温下比 在室温下更容易死亡。 （4）对干燥条件的适应性：微生物在干燥的环境中失 去大量水分，新陈代谢便会发生障碍，甚至引起菌体蛋 白质变性和由于盐类浓度的增高而逐渐导致死亡。不同 种类的微生物对干燥的抵抗力差异很大，如流感病毒相 对喜干燥，绝对湿度低时，流感病毒存活期就会延长， 传染率就增高。 （二）在环境中的稳定性 2与其它生物和环境的交互作用 在自然界，各种类的微生物能在多种不同的环境中生长繁殖。微生 物与微生物之间，微生物与其它生物之间彼此联系，相互影响，同时病 源微生物的毒性和传染性有可

14、能会根据它与寄主和环境的相互作用而发 生变化。通过了解病原微生物与其他生物和环境的交互作用可用于评估 发生实验室泄露时，评估环境因素对其影响。 病原微生物与其它生物和环境的交互作用主要有互生关系、共生关系 、拮抗关系、寄生关系以及适宜环境下促生长作用，即：与其他生物可 分可合，合比分好的互生关系；与其他生物共居在一起相互分工协作， 彼此分离就不能很好地生活的共生关系；一种微生物在其生命活动中， 产生某种代谢产物或改变环境条件，从而抑制其它微生物的生长繁殖， 甚至杀死其它微生物的拮抗关系；或在其他生物体内或体表，从后者获 得营养，进行生长、繁殖，并使后者蒙受损害甚至被杀死的寄生关系。 同时还应考

15、虑不同环境条件对病原微生物的生长促进作用，如富含鸟类 粪便和湿润的土壤适宜荚膜组织胞浆菌的生长繁殖；不同病原微生物相 互间可能重配形成新变种，如流感病毒的重配。 （四）对理化因子的敏感性 收集病原微生物对物理或化学因子的敏感性 相关资料，主要可用于实验室物理或化学消毒灭菌 方法以及实验样品灭活制剂的种类、工作浓度与作 用时间的的选择。 1.对物理因素的敏感性 收集并比较热力、辐射两类物理方法对该病原 微生物灭杀效果。其中热力灭菌法有干热灭菌和湿 热灭菌两大类，干热灭菌法又包括焚烧、烧灼、干 烤等。湿热消毒灭菌法主要包括：巴氏消毒法，用 较低温度杀灭液体中的病原菌或特定微生物，而仍 保持物品中所需的不耐热成分不被破坏的消毒方法 ；煮沸法与高压蒸汽灭菌法，辐射杀菌的方法主要 有紫外线、电离辐射、微波等。 2.对不同化学试剂（消毒剂）的敏感性 应收集化学消毒剂对该病原微生物的消毒效果 ，除考虑其杀菌能力的强弱，将化学消毒剂分为高 水平、中等水平和低水平三个级别外，还应考虑消 毒剂空气消毒，器械、实验样品或人体等不同消毒 对象，并了解了外界因素对消毒的效果影响如：消 毒剂的浓度、温度、酸碱度、表面涨力，有机物、 微生物的种类和数量等。 同时还应收集消毒剂的腐蚀