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1、ELISA与ELISPOT检测技术 酶联免疫吸附试验（ELISA） 酶联免疫斑点试验（ELISPOT） 酶联免疫吸附试验 (ELISA) ELISA技术简介 ELISA的基本原理 ELISA的类型和方法 ELISA方法注意事项和应用 酶联免疫吸附试验（ELISA） 酶联免疫吸附试验( Enzyme-Linked Immunosorbent Test, ELISA ) ： 基于抗原-抗体反应的特异性和等比例性，是酶免疫测定技 术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附 （包被）在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板，也称酶标板 ) 表 面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将
2、液 相中的游离成分洗除，加入相应的酶底物后发生颜色反应，通 过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，通过颜色反应 的深浅检测标本中相应抗体或抗原含量的检测技术 。 ELISA的发展概况 自从Engvall和Perlman（瑞典，1971）首次报道建立酶联免 疫吸附试验（ELISA）以来，由于ELISA技术具有快速、敏感 、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用 。 随着生物技术的快速发展，将利用基因工程技术制备的抗原 或单克隆抗体包被酶标板后，极大地提高了ELISA检测技术的 特异性，加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，使 ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最
3、广泛应用的检 测方法之一。 目前，ELISA检测技术在科学研究、疾病诊断、检验检疫 、环境监测等诸多领域广泛应用。 ELISA的基本原理 酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗 体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可 与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶 液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成 有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来 判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或 抗原的量呈正比。此种显色反应可通过分光光度计进行定量测定 ，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起 来
4、，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。 基本原理 ELISA试剂盒的组成 完整的ELISA试剂盒通常包含以下各组分： （1）已包被抗原或抗体的固相载体（俗称酶标板）； （2）酶标记的抗原或抗体（酶标记物）； （3）酶的底物； （4）参考标准品（定量试剂盒）及其稀释液； （5）酶标记物及样本的稀释液； （6）洗涤液（通常为浓缩液，用前按比例稀释）； （7）反应终止液； （8）封口膜若干、说明书一份。 酶标板 ELISA常用酶类 辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP) DH2+ H2O2 D + H2O 上式中，DH2为供氢体，H2O2为受氢体。 常用
5、底物： 1. 邻苯二胺(OPD)，产物为橙红色（492nm检测）； 2. 四甲基联苯胺(TMB)，产物为蓝色，酸性条件下变为 黄色（450nm检测）。 反应终止液：HCl或H2SO4溶液。 碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP) 常用底物： 1. 对硝基苯磷酸酯 ( p-NPP )，产物为黄色的对硝基酚 （405nm检测）； 2. 发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮），可用于荧光测定， 灵敏度高于显色底物的方法。 反应终止液：NaOH 溶液。 ELISA所需仪器设备 恒温箱洗板机酶标仪 ELISA的类型和方法 半定量ELISA试验 定量ELISA试验 试验目的 试验性质 间接
6、法 双抗夹心法 (直接夹心法) BAS-ELISA 双夹心法 (间接夹心法) 竞争法ELISA 直接法 直接法ELISA是将酶标抗原或抗体直接与包被在酶标板上 的抗体或抗原结合形成酶标抗原-抗体复合物，加入酶反应底物 ，测定产物的吸光值，计算出包被在酶标上的抗体或抗原的量 （见后图） 。该方法可用于检测抗体或抗原。 直接法ELISA 优点: 1. 特异性高、准确性好； 2. 实验操作简便，用时短。 缺点: 1. 应用范围较小，生产难度大。 需制备各种酶标抗原或抗体。 间接法ELISA 间接法ELISA是将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被 在酶标板的抗原结合形成抗原-抗体复合物后，再以酶标二
7、抗和 复合物结合，通过测定酶反应产物的颜色可以（间接）反映一抗 和抗原的结合情况，进而计算出抗原或抗体的量（见后图）。 该方法可用于抗体检测，是目前检测抗体最常用的ELISA方 法。 优点: 1. 适用范围广，无需制备特殊的酶标抗体; 2. 制备方便，价格便宜。 双抗夹心法ELISA 双抗夹心法是先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获 抗原，在用酶标的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-酶标抗体复合 物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值，计算出捕获的抗原量 ，本方法也称为直接夹心法（见后图） 。 该方法可用于抗原检测，例如细胞因子、激素、蛋白质、细 菌、病毒等，是目前检测抗原最常用的ELISA方法
8、。 优点: 1. 适用范围广，无需制备特殊的酶标抗体。 2. 制备方便，价格便宜。 双夹心法ELISA 双夹心法是先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获抗 原，然后用未标记的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-未标记抗体 复合物；再应用酶标二抗和抗体-抗原-未标记抗体复合物结合， 形成抗体-抗原-未标记抗体-酶标二抗复合物，也称为间接夹心法 （见后图）。 该方法可用于抗原检测，例如蛋白质、病原体等。 优点: 1. 灵敏度高。 2. 制备方便，无需制备特殊的酶标抗体。 缺点: 实验操作较复杂。 BAS-ELISA BAS-ELISA即生物素-亲和素系统（biotin avidin system, B
9、AS）ELISA法：是先将抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原， 然后用生物素（biotin）标记的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-生 物素标记抗体复合物，再依次加入亲和素、酶标记生物素（或直 接加入酶标记的亲和素），最后加底物显色。 生物素是一种生长因子，广泛分布于动、植物体内，又称辅 酶R或维生素H。亲和素由四个亚单位组成，对生物素具有高度 亲和力，即一个亲和素可以结合4个生物素分子。因此，本方法 具有信号放大功能（特点）。 该方法可用于抗原、抗体以及DNA和RNA（生物素）检测 。 BAS-ELISA实验原理 竞争法ELISA 竞争法ELISA的实验原理：将包被了抗体的酶标板的微孔分 为测定孔
10、和对照孔，在对照孔中加入已知浓度的系列标准品溶液 和酶标记物（酶标抗原）；在测定孔中同时加入酶标抗原和待检 样本（抗原），酶标抗原和样品互相竞争包被抗体的结合点，形 成酶标记的抗原-抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标抗 原通过洗涤去除，加入底物后，复合物上的酶催化底物生成有色 产物。当测定孔内的样本不含抗原时，固相上的抗体将和酶标抗 原结合，加入底物后显色较深；当样本含有抗原时，样本中的抗 原和酶标抗原共同竞争抗体的结合位点。酶标抗原结合的比例越 高，说明结合在固相抗体上的待测抗原就越少，反之亦然；在一 定的条件下，复合物上酶的量和酶产物呈现的色泽成正比，用分 光光度计进行测定，从而计算出
11、参与反应的抗原和抗体的量，从 而进一步得知样本中抗原的多少。 测定孔 E E E E E 酶标记物底物溶液 对照孔 E E E E E E E E E E E E E E E 酶标记物 底物溶液 参考液(不含抗原) E E 样本(含抗原) 竞争法ELISA实验原理 半定量ELISA试验 间接法检测血清HBsAb含量 设计加板次序 (空孔、阴、阳) 加板 (阴、阳、样) 37, 30min 加酶标抗体 (空孔除外) 洗涤3次，拍干 加底物溶液 (空孔除外) 37, 10-30min 加终止液 (空孔除外) 避光 上机检测、结果判定 (空孔调零) 37, 30min 洗涤3次，拍干 双抗夹心法检测
12、血清IL-2含量 设计加板次序 (空孔、阴、阳、标准) 加板 (阴、阳、标准、样) 37, 30min 加酶标抗体 (空孔除外) 洗涤3次, 拍干 加底物溶液 (空孔除外) 37, 10-30min 加终止液 (空孔除外) 避光 上机检测、绘制标准曲线 (空孔调零) 从标准曲线上 读取样品含量 37, 30min 洗涤3次, 拍干 ELISA试验中的注意事项 必须设立阳性、阴性和空孔对照孔，控制试验条件并检验 试剂盒的质量； 待测样品应设立双复孔或三复孔； 半定量（或定性）ELISA中结果判断依据通常为： OD样/OD阴2.1时为阳性结果，2.1时为阴性； 酶标板洗涤时确保洗涤干净，避免假阳性
13、； 定量ELISA中每一批次的试剂盒必须绘制一个标准曲线； 定量ELISA中还应特别注意试剂盒的灵敏度(测定范围)。 ELISA试验的应用 抗体及抗体亚类检测（包括血清、制备的抗体溶液等） 抗原检测（包括制备的抗原、毒素、病原体等）； 激素及其他生物活性分子检测（如HCG检测等）； 细胞因子及其受体检测（人、小鼠、大鼠等来源）； BAS-ELISA还可用于核酸（DNA/RNA）检测； 酶联免疫斑点试验（ELISPOT） ELISPOT技术简介 ELISPOT的基本原理 ELISPOT的实验方法 ELISPOT技术的应用 ELISPOT技术简介 酶联免疫斑点试验( Enzyme linked i
14、mmunospot assay, ELISPOT) 随着酶联免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用, 使 体外检测各种细胞因子及抗体研究有了新的突破。在研究免疫 应答机制时，以往常用ELISA方法检测体液中游离的细胞因子 （CK）或抗体，但由于游离的CK或循环抗体的半哀期不同， 使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反 映体内的抗体及CK 的水平。80 年代，国外的科研工作者根据 ELISA 技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞 和 CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT）。因其 具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用，对探 索自身免疫系统疾
15、病发病机制具有重要意义。 ELISPOT的发展概况 Sedgwich JD (澳大利亚)和Czerkinsky CC (瑞典)等人几乎同 时在1983年，运用该技术成功地检测出因受激而分泌抗体的 B细胞频率。 底板材料的发展：普通塑料板(1983) 硝酸纤维素膜 (NC膜, 1985) 聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜) 透明板(1997, 荷兰U-Cytech公司) 抗体制备技术的发展：上世纪90年代后抗体制备技术提升。 检测内容的发展：由抗体检测向细胞因子检测。 发展趋势：1. 多种细胞因子在同一孔板中同时检测。 2. 试验操作的标准化、规范化。 ELISPOT的技术特点 灵敏度高：在一百万个阴性细胞中只要有一个分泌细胞因子 的阳性细胞即可被检测出来。是目前最为灵敏 的检测技术， 灵敏度比传统的的ELISA方法高2-3个数量级 。 单细胞水平，活细胞功能检测 ：检测的是单个活细胞分泌功 能，而非细胞群体的 平均分泌功能。 操作简便经济，可以进行高通量筛选 ：没有复杂的细胞体外 扩增过程，不使用同位素，不需要大型的、专门的实验仪器 设备。按照标准化的实验操作，一个实验者可以同时处理数 百个样 品，效率远远高于其它检测方法 。 ELISPOT的基本原理 细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单 克
