《ELISA和ELISPOT标准检测技术》由会员分享,可在线阅读,更多相关《ELISA和ELISPOT标准检测技术(37页珍藏版)》请在金锄头文库上搜索。
1、ELISA与ELISPOT检测技术 酶联免疫吸附试验(ELISA) 酶联免疫斑点试验(ELISPOT) 酶联免疫吸附试验 (ELISA) ELISA技术简介 ELISA的基本原理 ELISA的类型和方法 ELISA方法注意事项和应用 酶联免疫吸附试验(ELISA) 酶联免疫吸附试验( Enzyme-Linked Immunosorbent Test, ELISA ) : 基于抗原-抗体反应的特异性和等比例性,是酶免疫测定技 术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附 (包被)在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板,也称酶标板 ) 表 面,使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行,用洗涤法将
2、液 相中的游离成分洗除,加入相应的酶底物后发生颜色反应,通 过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应,通过颜色反应 的深浅检测标本中相应抗体或抗原含量的检测技术 。 ELISA的发展概况 自从Engvall和Perlman(瑞典,1971)首次报道建立酶联免 疫吸附试验(ELISA)以来,由于ELISA技术具有快速、敏感 、简便、易于标准化等优点,使其得到迅速的发展和广泛应用 。 随着生物技术的快速发展,将利用基因工程技术制备的抗原 或单克隆抗体包被酶标板后,极大地提高了ELISA检测技术的 特异性,加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用,使 ELISA更为简便实用和标准化,从而使其成为最
3、广泛应用的检 测方法之一。 目前,ELISA检测技术在科学研究、疾病诊断、检验检疫 、环境监测等诸多领域广泛应用。 ELISA的基本原理 酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合,此种结合不会改变抗 体的免疫学特性,也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可 与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶 液后,底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成 有色的氧化型,出现颜色反应。因此,可通过底物的颜色反应来 判定有无相应的免疫反应,颜色反应的深浅与标本中相应抗体或 抗原的量呈正比。此种显色反应可通过分光光度计进行定量测定 ,这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起 来
4、,使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。 基本原理 ELISA试剂盒的组成 完整的ELISA试剂盒通常包含以下各组分: (1)已包被抗原或抗体的固相载体(俗称酶标板); (2)酶标记的抗原或抗体(酶标记物); (3)酶的底物; (4)参考标准品(定量试剂盒)及其稀释液; (5)酶标记物及样本的稀释液; (6)洗涤液(通常为浓缩液,用前按比例稀释); (7)反应终止液; (8)封口膜若干、说明书一份。 酶标板 ELISA常用酶类 辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP) DH2+ H2O2 D + H2O 上式中,DH2为供氢体,H2O2为受氢体。 常用
5、底物: 1. 邻苯二胺(OPD),产物为橙红色(492nm检测); 2. 四甲基联苯胺(TMB),产物为蓝色,酸性条件下变为 黄色(450nm检测)。 反应终止液:HCl或H2SO4溶液。 碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP) 常用底物: 1. 对硝基苯磷酸酯 ( p-NPP ),产物为黄色的对硝基酚 (405nm检测); 2. 发荧光底物(磷酸4-甲基伞酮),可用于荧光测定, 灵敏度高于显色底物的方法。 反应终止液:NaOH 溶液。 ELISA所需仪器设备 恒温箱洗板机酶标仪 ELISA的类型和方法 半定量ELISA试验 定量ELISA试验 试验目的 试验性质 间接
6、法 双抗夹心法 (直接夹心法) BAS-ELISA 双夹心法 (间接夹心法) 竞争法ELISA 直接法 直接法ELISA是将酶标抗原或抗体直接与包被在酶标板上 的抗体或抗原结合形成酶标抗原-抗体复合物,加入酶反应底物 ,测定产物的吸光值,计算出包被在酶标上的抗体或抗原的量 (见后图) 。该方法可用于检测抗体或抗原。 直接法ELISA 优点: 1. 特异性高、准确性好; 2. 实验操作简便,用时短。 缺点: 1. 应用范围较小,生产难度大。 需制备各种酶标抗原或抗体。 间接法ELISA 间接法ELISA是将酶标记在二抗上,当抗体(一抗)和包被 在酶标板的抗原结合形成抗原-抗体复合物后,再以酶标二
7、抗和 复合物结合,通过测定酶反应产物的颜色可以(间接)反映一抗 和抗原的结合情况,进而计算出抗原或抗体的量(见后图)。 该方法可用于抗体检测,是目前检测抗体最常用的ELISA方 法。 优点: 1. 适用范围广,无需制备特殊的酶标抗体; 2. 制备方便,价格便宜。 双抗夹心法ELISA 双抗夹心法是先将未标记的抗体包被在酶标板上,用于捕获 抗原,在用酶标的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-酶标抗体复合 物,加入酶反应底物,测定产物的吸光值,计算出捕获的抗原量 ,本方法也称为直接夹心法(见后图) 。 该方法可用于抗原检测,例如细胞因子、激素、蛋白质、细 菌、病毒等,是目前检测抗原最常用的ELISA方法
8、。 优点: 1. 适用范围广,无需制备特殊的酶标抗体。 2. 制备方便,价格便宜。 双夹心法ELISA 双夹心法是先将未标记的抗体包被在酶标板上,用于捕获抗 原,然后用未标记的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-未标记抗体 复合物;再应用酶标二抗和抗体-抗原-未标记抗体复合物结合, 形成抗体-抗原-未标记抗体-酶标二抗复合物,也称为间接夹心法 (见后图)。 该方法可用于抗原检测,例如蛋白质、病原体等。 优点: 1. 灵敏度高。 2. 制备方便,无需制备特殊的酶标抗体。 缺点: 实验操作较复杂。 BAS-ELISA BAS-ELISA即生物素-亲和素系统(biotin avidin system, B
9、AS)ELISA法:是先将抗体包被在酶标板上,用于捕获抗原, 然后用生物素(biotin)标记的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-生 物素标记抗体复合物,再依次加入亲和素、酶标记生物素(或直 接加入酶标记的亲和素),最后加底物显色。 生物素是一种生长因子,广泛分布于动、植物体内,又称辅 酶R或维生素H。亲和素由四个亚单位组成,对生物素具有高度 亲和力,即一个亲和素可以结合4个生物素分子。因此,本方法 具有信号放大功能(特点)。 该方法可用于抗原、抗体以及DNA和RNA(生物素)检测 。 BAS-ELISA实验原理 竞争法ELISA 竞争法ELISA的实验原理:将包被了抗体的酶标板的微孔分 为测定孔
10、和对照孔,在对照孔中加入已知浓度的系列标准品溶液 和酶标记物(酶标抗原);在测定孔中同时加入酶标抗原和待检 样本(抗原),酶标抗原和样品互相竞争包被抗体的结合点,形 成酶标记的抗原-抗体复合物固定在微孔内,没有吸附的酶标抗 原通过洗涤去除,加入底物后,复合物上的酶催化底物生成有色 产物。当测定孔内的样本不含抗原时,固相上的抗体将和酶标抗 原结合,加入底物后显色较深;当样本含有抗原时,样本中的抗 原和酶标抗原共同竞争抗体的结合位点。酶标抗原结合的比例越 高,说明结合在固相抗体上的待测抗原就越少,反之亦然;在一 定的条件下,复合物上酶的量和酶产物呈现的色泽成正比,用分 光光度计进行测定,从而计算出
11、参与反应的抗原和抗体的量,从 而进一步得知样本中抗原的多少。 测定孔 E E E E E 酶标记物底物溶液 对照孔 E E E E E E E E E E E E E E E 酶标记物 底物溶液 参考液(不含抗原) E E 样本(含抗原) 竞争法ELISA实验原理 半定量ELISA试验 间接法检测血清HBsAb含量 设计加板次序 (空孔、阴、阳) 加板 (阴、阳、样) 37, 30min 加酶标抗体 (空孔除外) 洗涤3次,拍干 加底物溶液 (空孔除外) 37, 10-30min 加终止液 (空孔除外) 避光 上机检测、结果判定 (空孔调零) 37, 30min 洗涤3次,拍干 双抗夹心法检测
12、血清IL-2含量 设计加板次序 (空孔、阴、阳、标准) 加板 (阴、阳、标准、样) 37, 30min 加酶标抗体 (空孔除外) 洗涤3次, 拍干 加底物溶液 (空孔除外) 37, 10-30min 加终止液 (空孔除外) 避光 上机检测、绘制标准曲线 (空孔调零) 从标准曲线上 读取样品含量 37, 30min 洗涤3次, 拍干 ELISA试验中的注意事项 必须设立阳性、阴性和空孔对照孔,控制试验条件并检验 试剂盒的质量; 待测样品应设立双复孔或三复孔; 半定量(或定性)ELISA中结果判断依据通常为: OD样/OD阴2.1时为阳性结果,2.1时为阴性; 酶标板洗涤时确保洗涤干净,避免假阳性
13、; 定量ELISA中每一批次的试剂盒必须绘制一个标准曲线; 定量ELISA中还应特别注意试剂盒的灵敏度(测定范围)。 ELISA试验的应用 抗体及抗体亚类检测(包括血清、制备的抗体溶液等) 抗原检测(包括制备的抗原、毒素、病原体等); 激素及其他生物活性分子检测(如HCG检测等); 细胞因子及其受体检测(人、小鼠、大鼠等来源); BAS-ELISA还可用于核酸(DNA/RNA)检测; 酶联免疫斑点试验(ELISPOT) ELISPOT技术简介 ELISPOT的基本原理 ELISPOT的实验方法 ELISPOT技术的应用 ELISPOT技术简介 酶联免疫斑点试验( Enzyme linked i
14、mmunospot assay, ELISPOT) 随着酶联免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用, 使 体外检测各种细胞因子及抗体研究有了新的突破。在研究免疫 应答机制时,以往常用ELISA方法检测体液中游离的细胞因子 (CK)或抗体,但由于游离的CK或循环抗体的半哀期不同, 使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合,而不能确切的反 映体内的抗体及CK 的水平。80 年代,国外的科研工作者根据 ELISA 技术的基本原理,建立了体外检测特异性抗体分泌细胞 和 CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术(ELISPOT)。因其 具有较高的特异性和敏感性,目前正被国内外广泛应用,对探 索自身免疫系统疾
15、病发病机制具有重要意义。 ELISPOT的发展概况 Sedgwich JD (澳大利亚)和Czerkinsky CC (瑞典)等人几乎同 时在1983年,运用该技术成功地检测出因受激而分泌抗体的 B细胞频率。 底板材料的发展:普通塑料板(1983) 硝酸纤维素膜 (NC膜, 1985) 聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜) 透明板(1997, 荷兰U-Cytech公司) 抗体制备技术的发展:上世纪90年代后抗体制备技术提升。 检测内容的发展:由抗体检测向细胞因子检测。 发展趋势:1. 多种细胞因子在同一孔板中同时检测。 2. 试验操作的标准化、规范化。 ELISPOT的技术特点 灵敏度高:在一百万个阴性细胞中只要有一个分泌细胞因子 的阳性细胞即可被检测出来。是目前最为灵敏 的检测技术, 灵敏度比传统的的ELISA方法高2-3个数量级 。 单细胞水平,活细胞功能检测 :检测的是单个活细胞分泌功 能,而非细胞群体的 平均分泌功能。 操作简便经济,可以进行高通量筛选 :没有复杂的细胞体外 扩增过程,不使用同位素,不需要大型的、专门的实验仪器 设备。按照标准化的实验操作,一个实验者可以同时处理数 百个样 品,效率远远高于其它检测方法 。 ELISPOT的基本原理 细胞受到刺激后局部产生细胞因子,此细胞因子被特异单 克