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1、 内蒙古大学本科毕业论文(设计) 学校代码 学号 分 类 号 密级 本科毕业论文不同土壤DNA提取和纯化试 剂盒及方法的比较学院、系 环境与资源学院 专业名称 环境科学 年 级 2010级 学生姓名 指导教师 2014年 5月 不同土壤DNA提取和纯化试剂盒及方法的比较摘 要环境样品DNA的提取和纯化不仅是土壤微生物进行研究的前提条件，而且是环境宏基因组学中最关键的技术问题之一，DNA的产量和纯度对后续的一系列的分子生物学技术操作如：多聚酶链反应(PCR)扩增、核酸内切酶酶切消化、核酸分子杂交等等，都会产生很大的影响，所以后续试验有效进行，必须要先获得一定纯度、数量、有较好代表性和适当片段长度
2、的DNA。本文针对三种典型的土壤类型（壤土、粘土和沙土），对目前应用比较广泛的三种不同的DNA 提取方法和四种不同的DNA 纯化方法的效果进行了比较。经过NanoDrop分光光度计和琼脂糖凝胶电泳对从三种典型土壤中提取和纯化的DNA的浓度和纯度进行检测，结果表明：Power Soil DNA提取试剂盒和苯酚 - 氯仿抽提，异丙醇沉淀纯化方法的结合能提供满足环境组学研究的宏基因组测序要求的DNA。关键词：土壤微生物,DNA,提取,纯化 内蒙古大学本科毕业论文(设计) Comparison of DNA extraction and purification methods from differ
3、ent soils Abstract The extraction and purification of DNA from environmental samples is not only a prerequisite for microbial research, and is one of the environmental metagenomics most critical technical issues, the yield and purity of DNA on the subsequent series of molecular biology techniques op
4、erate such as: polymerase chain reaction (PCR) amplification,restriction enzyme digestion, the nucleic acid hybridization, etc. will have a huge impact, if follow-up tests effectively, you must first obtain a certain purity, quantity, better DNA fragments representative and appropriate length. In th
5、is paper, we have compared several different methods of DNA extraction and purification for three different soil, loam, sandy clay . After a NanoDrop spectrophotometer and by agarose gel electrophoresis and purified from the extract of the soil of three DNA concentration and purity, and the results
6、showed that: Power Soil DNA extraction kit and phenol-chloroform extraction and isopropanol precipitation purification methods combined provides the right DNA for the study of environmental groups metagenomic sequencing. Keywords: Microbial soil, DNA , Extraction, Purification 内蒙古大学本科毕业论文(设计) 目录1.绪论
7、11.1研究背景11.2 国内外研究进展21.3 本文研究意义42.DNA的提取方法和纯化方法52.1 土壤样品52.2 DNA提取方法的比较52.2.1 原位裂解法52.2.2 PowerSoil DNA提取试剂盒（MoBio）62.2.3 Meta-G-Nome DNA 提取试剂盒(Illumina)72.3 DNA纯化方法的比较72.3.1 QIAEX II Gel 纯化试剂盒82.3.2 PowerClean DNA Clean-Up Kit（MoBio）82.3.3 The Agencourt AMPure XP PCR Purification system92.3.4 苯酚/氯仿
8、抽提和异丙醇沉淀92.4 DNA纯度与浓度的检测103.结果与讨论113.1 DNA提取方法的比较结果113.2 DNA纯化方法的比较结果11结论14致谢15参考文献16第 18 页 内蒙古大学本科毕业论文(设计) 不同土壤DNA提取和纯化试剂盒及方法的比较1.绪论1.1研究背景土壤微生物主要包括细菌、真菌、放线菌和藻类，是土壤生态系统的重要组成部分。土壤微生物不仅是生态系统的分解者，而且还是生态系统中养分的巨大来源，担负着分解动物、植物残体的重要责任，推动着生态系统的物质循环和能量流动，维持着生态系统的稳定性，它们在整个生态系统中扮演着非常重要的角色。 在传统的微生物学中，微生物的分离和培养
9、是研究利用微生物的第一步。但是，由于土壤环境的复杂性和培养条件的限制，如含有大量的化学无机物或者有机物，存在着对某些酶反应的抑制剂，如腐殖酸或腐殖酸的类似物，重金属离子，酚类化合物等等。一般认为，能用现有的技术培养的微生物仅仅占微生物总的种类数的1%左右，而不能培养的微生物才是环境微生物多样性的主体1-3。随着分子生物学的发展，研究方法和手段不断更新，土壤微生物的研究掀开了崭新的一页。微生物的基因组序列测定工作大规模展开和功能基因组学和生物信息学迅速发展，人们现在可以绕过微生物菌种分离培养这一步骤，直接在基因水平上研究和开发未培养微生物资源。宏基因组学这个概念是在1998 年首先由Handel
10、sman 等提出的，它的定义是“利用现代基因组技术直接研究自然状态环境中的微生物群落，而不需要经过分离、培养单一种类的微生物”4-5。现代基因工程新的研究热点和发展方向就是构建微生物的宏基因组文库并且筛选其生物活性物质。 而用适当的方法从土壤中提取并且纯化DNA，是从分子生物学的角度对土壤微生物进行研究的前提条件。后续一系列的分子生物学技术操作如：多聚酶链反应( PCR ) 扩增、核酸内切酶酶切消化、核酸分子杂交等等，都需要先获得一定纯度、数量、较好代表性和适当片段长度的DNA 6。DNA的提取和纯化不仅是土壤微生物进行研究的前提条件，而且是环境宏基因组学中最关键的技术问题之一，由于土壤成分复
11、杂不同，土壤样品之间差异较大，微生物仅是其中极少的一部分，加之，微生物细胞通常都紧密的吸附在颗粒表面。所以，从土壤样品中高效地获得DNA具有很大的难度。另外，土壤中通常含有大量影响对DNA进行分子操作的物质，因此，有效地纯化DNA也较为困难。再加上，由于对一些极端环境中的微生物的宏基因组的研究有望得到一些特殊的应用，这更对DNA的提取和纯化技术提出了挑战。1.2 国内外研究进展土壤DNA提取和纯化的方法有很多，而关于土壤DNA的提取方法，基本可以分为两类，一类是直接提取法，另一类是间接提取法。直接提取法是采用原位裂解土壤微生物的方法，这种方法所获得的基因组DNA都是粗提取液，含有很多杂质，如黄
12、酸、腐殖酸等等，会抑制下游的实验，因此，人们又尝试许多方法来去除腐殖酸的影响，其中Tiedje等人试验用PVPP( 聚乙烯吡咯烷酮) 和CTAB( 十六烷基三甲基溴化铵) 去除腐殖酸，获得了较好的效果7。由于土壤样品中一些含钙的物质具有极强的黏附DNA的能力，DNA经释放后很容易又被吸附到基质中。因此，对样品而言，细胞破壁是尤为重要的。不同的细胞裂解方法使提取的DNA质量有很大的差异，主要包括：物理法， 如：液氮研磨法、珠磨匀浆法、超声波法、煮沸法和冻融法等；化学法，如：盐类法、表面活性剂( SDS) 法和有机溶剂法等；酶解法，如裂解酶法、蛋白酶K 法和溶菌酶法等。各种裂解方法都有优势与不足，由于研究者的样品和所采用的方法不同，得出的结果也不完全相同8。物理法：Guthrie 等认为液氮研磨法可将嵌在沉积物中的细菌细胞暴露出来，并且液氮还有可能改变细菌周围粘土的结构9。宫强等比较了酚/ 氯仿抽屉法、改良CTAB法、CTAB法和液氮研磨法等DNA提取方法，发现
