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1、1.2 基因工程的基本操作程序 二.基因表达载体的构建 三、将目的基因导入受体细胞 四、目的基因的检测与鉴定 一.目的基因的获取 一.目的基因的获取 1.基因的结构 2.目的基因的概念 3.目的基因的获取的方法 1.基因的结构 （1）原核生物基因结构 编码区非编码区 非编码区 编码区上游 编码区下游 编码蛋白质 调控遗传信息的表达 （调控程序） AATGTGCACGTAGTTAG TTACACGTGCATCAATC 启动子终止子 编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区 启动子终止子 ATGTGCACGTAGTTAATGTGCACGTAGTTA TACACGTGCATCAATTACACGT
2、GCATCAAT RNARNA聚合酶聚合酶 AUGUGCACGUAGUUAAUGUGCACGUAGUUA 启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起 始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。 RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合 的一种蛋白质. 终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它 能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离 下来，使转录终止。 编码区非编码区非编码区 （能编码蛋白质） 启动子终止子 （2）真核与原核生物基因结构的比较 外显子内含子 编码蛋白质 （不能编码蛋白质） 相同点：都是由能够编码蛋白质的编码区和具有 调控作用的非编码
3、区。 不同点：原核细胞基因的编码区是连续的；真 核细胞的编码区是间隔的，不连续的。 2.目的基因的概念 主要是指编码蛋白质基因 例如：与生物抗逆性相关的基因，与生物 优良品质相关的基因，药物和保健品相关 的基因，与毒物降解相关的基因，以及与 工业所需要酶相关的基因。 目前被广泛提取使用的目的基因有： 苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（ 抗病毒、抗细菌抗病毒、抗细菌) )、人胰岛素基因等。 3.目的基因的获取的方法 （4）从已有物种分离出目的基因 （3）用化学方法直接人工合成目的基因 （1）从基因库中获取目的基因 （2）应用PCR技术扩增目的基因 （1）从基因库中获取目的基因 基因文库和部分基因
4、文库的慨念 基因组文库和cDNA文库的主要区别 怎样从基因文库中找到我们所需要的目的 基因 基因文库和部分基因文库的慨念： 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导 入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生 物的不同的基因,称为基因文库。 基因文库中包含了一种生 物所有的基因,这种基因文库 叫做基因组文库。 基因文库中包含 了一种生物的一部分基 因,这种基因文库叫做 部分基因文库。如： cDNA文库。 基因组文库的建立方法 提取某种生物的全部DNA 用适当的限制酶酶切 一定大小的DNA片段 将DNA片段与运载体连接 导入受体菌中储存 基因组文库 方法一：直接分离法(鸟枪法 ) 在细胞质
5、中将mRNA分离 并加入反转录酶 合成第二条DNA链 外显子内含子 外显子外显子内含子 真核细胞的基因 在细胞核内转录 RNA 在核内内含子被切去， 外显子彼此连接 在细胞质中将mRNA分离 并加入反转录酶 合成第二条DNA链 基因的cDNA 不含内含子 mRNA 原核细胞的基因 在细胞质内转录 基因组文库和cDNA文库的主要区别 文库类型 cDNA文库 基因组文库 文库大小 基因中启动子（具有启动作用的 DNA片段） 基因中内含子(位于编码蛋白质序 列的非编码DNA片段） 基因多少 物种间的基因交流 小大 无 有 无 有 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 可以部分基因可以 怎样从基因文
6、库中找到我们所需要的目的基因 根据目的基因的有关信息，例如，根据基因 的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的 位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达 产物蛋白质等特性来获取目的基因。 （2）应用PCR技术扩增目的基因 定义： 原理：DNA复制 PCR是聚合酶链式反应，是一项在生物 体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，在 短时间内大量扩增目的基因 DNA分子热变性（在9095 OC时，解旋 ，双链分开温度降低又结合成双链）因此，在 PCR技术中不需要解旋酶（与复制不同之在处 ) 仪器： PCR扩增仪（自动调控温度的仪器） 条件： 有一段已知的基因的核苷酸序列，以便 根据这一序列合成引
7、物，脱氧核苷酸， 酶等。 过程： a.DNA热变性（9095 OC)： b.复性（5560 OC) ： c.延伸（7075 OC)： d.重复a.b.c步骤： 双链DNA模板在热的作用 下，氢键断裂形成单键DNA 系统温度降低，引物结合到互补 DNA链上，形成局部的双链DNA 在Taq酶作用下，合成与模板 互补的DNA子链，形成双链DNA 每重复一次，目的基因增加 一倍 PCR扩增为指数形式扩增2n(n为扩增循环的 次数），在短时间内扩增大量目的基因。 用化学方法直接人工合成目的基因 反转录法 mRNARNA与DNA杂交链单链DNA双链DNA 逆转录酶 核苷酸酶HDNA聚合酶 cDNA化学合成
8、法 氨基酸序列mRNA序列目的基因序列目的基因 推测 合成 思考： 不具有，缺少非编码区(启动子、终止子）和非 编码序列（如内含子），要人工构建。 人工合成的目的基因是否具有完整基因结 构的基因？ 推测 1 1. .作用作用： 二. 基因表达载体的构建核心 IMNIMN 2 2. .组成组成： 使目的基因在受体细胞中稳定存在使目的基因在受体细胞中稳定存在 并遗传给子代并遗传给子代。 同时使目的基因能表达和发挥作用。同时使目的基因能表达和发挥作用。 (3)终止子：是使转录在需要的地方停止。 (4)标记基因：是鉴别受体细胞中是否含有目的基因 从而将含有目的基因的细胞筛选出来。 (2)启动子：是RN
9、A聚合酶识别和结合部位。 (1)目的基因。 （5）复制原点：是转录和复制的起点。 不同受体细胞，目的基因导入受体细胞的方法不 同，基因表达载体的构建有所差异。 导入 接种 培养 接种 培养 接种 培养 接种 培养 含有四环素的 完全培养基 完全培养基 大肠杆菌不含 抗四环素基因 证明： 不存活 含有四环素的 完全培养基 证明 ： 大肠杆菌含抗 四环素基因 证明： 大肠杆菌 的受体细胞含 有目的基因 四环素 抗性基因 四环素 抗性基因 完全培养基 存活 如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？ 存活的大肠杆菌 培养 培养 质粒来源： 大肠杆菌 含有氨苄青霉素 的完全培养基 含有四环素的 完全培养
10、基 人工改造质粒 （选择具有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因农杆菌） 质粒 知识拓展知识拓展 Hin d限制性酶 Hin dIIIHin dIII 目的DNA 质粒 构建表达载体 四环素抗性基因由于目的基因插入而失 活，形成只具有氨苄青霉素抗性基因 DNA连接酶 人类胰岛素的基因 培养 培养 培养 导入 含目的基因的重组质粒导入大肠杆菌 含有氨苄青霉素 的完全培养基 含有四环素的 完全培养基 两种培养基均不能生长大肠杆 菌 Ca2+ 处理细胞 形成感受态细胞 检测 （培养不具有氨苄青霉素 抗性基因和四环素抗性积基因的大肠杆菌） 只有氨苄青霉素 抗性基因质粒 只具有氨苄青霉素 抗性基因大肠杆菌
11、 不具有氨苄青霉 素 抗性基因和 四环素抗性积基 因的大肠杆菌 完全培养基 培养 检测含重组质粒的大肠杆菌 含有氨苄青霉素 的完全培养基 含有四环素的 完全培养基 （大肠杆菌内含有氨苄青霉素抗性基因，不含有四环素抗性基因） 只具有氨苄青霉素 抗性基因农杆菌 不存活 存活 证明：目的基因已导入质粒 培养 培养 完全培养基 培育出得 到能够发酵产 生人类胰岛素 的工程菌。 寻根问底： 将生物的所有DNA直接导入受体 细胞不是更简便吗？如果这么做，结果 会怎样？ 有人采用总DNA注射法进行遗传转化：即将一 个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通 道法导入受体细胞，没有进行表达载体的构建。 这
12、种方法针对性差，完全靠运气，也无法 确定什么基因导入了受体细胞。此法目前争议 颇多，严格来说不算基因工程。 资资 料料: : 科学家在培育抗虫棉时，起初把 苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体 质粒中，然后导入棉花的受精卵中， 结果抗虫基因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入抗虫基因启动 子，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫 能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入 抗虫基因终止子，导入棉花受精卵，结果成长的植株 ，有了抗虫能力。 资料证明：载体构建组成要完整 三、将目的基因导入受体细胞 1.转化： 目的基因进入受体细胞内，并且在受体 细胞内维持稳定和表达的工程 2
13、.常见转化方法： （1）将目的基因导入微生物细胞感受态细胞法。 农杆菌转化法：双子叶植物和裸子植物。 （2）将目的基因导入植物细胞 基因枪法：单子叶植物。 花粉管通道法：双子叶植物。 显微注射法。（3）将目的基因导入动物细胞 常用法：常用法： 常用菌：常用菌： 微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 过程：过程： 大肠杆菌大肠杆菌 CaCa2+ 2+处理 处理获得感受态细胞获得感受态细胞 CaCa2+ 2+处理 处理 大肠杆菌大肠杆菌 感受态感受态 细胞细胞 表达载体表达载体 与感受态与感受态 细胞混合细胞混合 感受态
14、细胞感受态细胞 吸收吸收DNADNA _感受态细胞法： （1）将目的基因导入微生物细胞 例： 若通过基因过程生产人的糖蛋白可以用 大肠杆菌作为工程菌吗？ 不可以，糖蛋白上的糖链是在内质网 和高尔基体上加工完成，而内质网和高尔 基体存在真核细胞中，大肠杆菌是原核生 物，细胞中不含这两种细胞器。 以酵母菌作为工程菌可以吗? 可以，酵母菌为真核生物（真菌类）。 特点特点: : 农杆菌转化法： （2）将目的基因导入植物细胞 能感染能感染双子叶植物双子叶植物和和祼子植物祼子植物, ,对单子叶对单子叶 植物植物没有没有感染能力感染能力 过程过程： TiTi质粒的质粒的TDNATDNA可转移至受体细胞并整合
15、到其染色体上可转移至受体细胞并整合到其染色体上 适用生物： 双子叶植物双子叶植物、祼子植物祼子植物。 Hin d限制性酶 Hin dIIIHin dIII 目的DNA Ti质粒 苏云金杆菌 构建表达载体 Bt毒素蛋白基因 苏云金杆菌 DNA连接酶 T-DNA (可转移-DNA) 知识拓展知识拓展农杆菌转化法的过程： 培养 培养 导入 含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌 含有氨苄青霉素 的完全培养基 不能存活 Ca2+ 处理细胞 形成感受态细胞 检测 农杆菌 农杆菌 （培养不具有氨苄青霉素 抗性基因和四环素抗性积基因的农杆菌） 具有氨苄青霉素抗 性基因的农杆菌 农杆菌 不具有氨苄青霉 素 抗性基因的 农杆菌 完全培养基 含有氨苄青霉素 的完全培养基 农杆菌 证明： 目的基 因已导 入 存活 脱分化 组织培养 脱分化 农杆菌 导入植物细胞通过组织培养产生新个体 再分化 移植 个体生物学 水平的鉴定 如虫吃后中毒死亡，则说明 摄入了抗虫基因并得到表达 导入植 物细胞 组织培养 花粉管通道法： 将目的基因导入植物细胞 操作方法： 特点： 在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前 期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含的
