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1、实验六实验六 微生物微生物( (细菌细菌) )基因组基因组DNADNA的提取的提取 一、实验原理 1、核酸的分类 l DNA 主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA ，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（ cpDNA），质粒DNA。 l RNA 存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。 l 除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和 噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。 l分离纯化核酸总的原则： 应保证核酸一级结构的完整性； 排除其它分子的污染。 l核酸纯化应达到的要求： 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高 浓度的金属离子； 其它生物大分
2、子的污染应降低到最低程度； 排除其它核酸分子的污染。 2、核酸制备的一般原则 一、实验原理 l核酸制备时应注意的事项: 尽量简化操作步骤，缩短提取过程。 减少化学因素对核酸的降解。 减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温 防止核酸的生物降解。 3、核酸制备的一般原则 一、实验原理 l核酸制备的步骤 ： 破碎细胞破碎细胞 提取提取 纯化纯化 I.材料准备 II.破碎细胞或包膜内容物释放 III.核酸分离、纯化 IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质 V.核酸溶解在适量缓冲液或水中 l核酸酶的抑制和抑制剂 降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶 活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当
3、然，几个条件并用更好。 对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械 张力拉断则更重要。 对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断， 但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制 RNase更重要。 4、核酸制备的一般方法和原理 一、实验原理 l核酸酶的抑制和抑制剂 DNase抑制 加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L EDTA 或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。 去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使 DNase失活。 l核酸酶的抑制和抑制剂 RNase抑制 操作要带手套。 所有器皿要严格消毒， 试剂处理 低温操作 在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。
4、l核酸制备中常用的去垢剂 核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用 于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂 ，去垢剂的作用： 1溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸 释放出来； 3对RNase、DNase有一定的抑制作用。 如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠 、三异丙基萘磺酸钠 l核酸制备中常用的蛋白质变性剂 蛋白质变性剂的作用： 1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造 成蛋白污染。 2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。 3.某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用 。 如：苯酚、氯
5、仿、盐酸胍、DEPC l核酸制备中常用的酶 DNase RNase 蛋白酶K 溶菌酶 l核酸提取的一般过程 1）破碎细胞（防止核酸酶的作用） 微生物：溶菌酶、SDS裂解。 高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。 酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶， 冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎 。 动物：液氮处理后用匀浆器破碎。 细胞器DNA：首先纯化细胞器。 以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂 l核酸提取的一般过程 2）破碎抽提核酸除去杂质 1首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与 其它成分分离 2使核酸与蛋白质分离 3除去脂类 4多糖的除去 l核酸提取的一般过程 3）核酸的纯化 根据所需核酸的性质和特点除去其
6、它核酸污 染,并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂 等）杂质，最后得到均一的核酸样品。 4）核酸样品的保存 核酸保存的主要条件是温度和介质 温度： 4（5）最佳和最简单 -70是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20保存 保存介质： TE缓冲溶液(最常用) 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0 二、材料、设备及试剂 菌种 ：细菌 设备 ：eppendorf管、微量取液器(20l,200l,1000l)， 台 式高速离心机， 涡旋振荡器 试剂：TE缓冲液、10%（w/v）十二烷基硫酸钠（SDS）、20mg/ml 蛋白酶K、5mol/L NaCl
7、溶液、CTAB/ NaCl溶液、24：1氯仿/异戊 醇、25：24：1酚/氯仿/异戊醇、异丙醇、70%乙醇 、 1培养5ml的细菌培养物至饱和状态，取1.5ml的培养 物12000rpm离心5min。 2沉淀物加入567l 的TE缓冲液，用吸管反复吹打使 之重悬。加入30l 10%的SDS和3l 20mg/ml的蛋白酶 K，混匀，于37温育0.5h。 3加入100l 5 mol/L NaCl，充分混匀，再加入 80l CTAB/ NaCl溶液，混匀，于65温育10min。 三、操作步骤 4加入等体积的氯仿异戊醇，混匀，10000*g，离心 4min。将上清液转入一个新管中。 5加入等体积的酚/
8、氯仿/异戊醇，混匀， 10000*g,离心5min，将上清转入一只新管中。 6加入0.6体积异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来 ， 12000*g,离心5分钟，去上清，用 70%乙醇洗涤 。 77500*g,离心5min，弃上清，自然干燥，重溶于 30l 的TE缓冲液。 四、注意事项四、注意事项材料准备材料准备 最好使用新鲜材料，低温保 存的样品材料不要反复冻融 提取血液基因组DNA时，要 选择有核细胞（白细胞） 组培细胞培养时间不能过长 ，否则会造成DNA降解 含病毒的液体材料DNA含量 较少，提取前先富集 四、注意事项四、注意事项细胞裂解细胞裂解 材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量
9、少，纯度低 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式 ： 植物材料液氮研磨 动物组织匀浆或液氮研磨 组培细胞蛋白酶K 细菌溶菌酶破壁 酵母破壁酶或玻璃珠 高温温浴时，定时轻柔振荡 四、注意事项四、注意事项核酸分离、纯化核酸分离、纯化 采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提 供相应的缓冲体系 采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但 动作要轻柔 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间 四、注意事项四、注意事项核酸沉淀、溶解核酸沉淀、溶解 当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀， 沉淀会更充分 沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利 于充分沉淀 沉淀后应用70的乙醇洗涤，以
10、除去盐离子等 晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥） 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解 TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase pH值为8.0，可防止DNA发生酸解 1.DNA中含有蛋白、 多糖、多酚类杂质 2.DNA在溶解前，有 酒精残留，酒精抑 制后续酶解反应 3.DNA中残留有金属 离子 1.重新纯化DNA，去 除蛋白、多糖、多酚 等杂质 2.重新沉淀DNA，让 酒精充分挥发 3.增加70乙醇洗涤 的次数（2-3次） 五、五、DNADNA提取常见问题提取常见问题 q问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。 原 因 对 策 1.材料不新鲜或反复冻 融 2
11、.未很好抑制内源核酸 酶的活性 3.提取过程操作过于剧 烈，DNA被机械打断 4.外源核酸酶污染 5.反复冻融 1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避 免反复冻融 2.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻 前加入裂解缓冲液 3.在提取内源核酸酶含量丰富的材料 的DNA时，可增加裂解液中螯合剂 的含量 4.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 5.所有试剂用无菌水配制，耗材经高 温灭菌 6.将DNA分装保存于缓冲液中，避免 反复冻融 q问题二：DNA降解 对 策 原 因 五、五、DNADNA提取常见问题提取常见问题 1.实验材料不佳或量少 2.破壁或裂解不充分 3.沉淀不完全 4.洗涤时DNA丢失 1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材 料 2.动植物要匀浆研磨充分；G 菌、酵母裂解前先用生物酶 或机械方式破壁 3.高温裂解时，时间适当延长 （对于动物细胞、细菌可增 加PK的用量） 4.低温沉淀，延长沉淀时间 5.加辅助物，促进沉淀 6.洗涤时，最好用枪头将洗涤 液吸出，勿倾倒 q问题三：DNA提取量少 对 策 原 因 五、五、DNADNA提取常见问题提取常见问题 1简要叙述酚氯仿抽提体系后出现的现 象及其成因。 2.沉淀时为什么要用无水乙醇？ 六、问题与讨论六、问题与讨论
