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1、分类号 华中农业大学硕士学位论文 l830 80 密级 早实枳T F L l C E N 同源基因的表达分析及功能特征 E X P R E S S I O NA N A L Y S I SA N DF U N C T I o N A LC H A R A C T E R I S T I C S o F 刀呓J 删H o M o L O G o U SG E N Eo F P o N c I R U sT R IF o L I A T Am ) R a f 研究生：李红莲 指导教师：胡春根教授 指导小组：罗正荣教授 蔡礼鸿教授 邓伯勋教授 姜玲教授 专业：果树学 获得学位名称：农学硕士 研究方向
2、：果树基因工程 获得学位时间：2 0 1 0 年6 月 华中农业大学园艺林学学院园艺植物教育部重点实验室 二O O 年六月 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 Y 1 7 9 9 7 6 1 I 谶獭嗡撼赚嘲m 喵豫m l | l l 学位论文 是否保密歪 如需保密，解密时间年 月日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究 所做的任
3、何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：巷么) 走 时间：扣f 口年6 月J 6 1 日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关予保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照 学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印，缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力 注：保密学位论文( 印涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的 论文) 在解密后适用于本授权书 撇槲张私生
4、撇名： 签名日期：函b 年i 月f 日 签名日期：2 , vo # - 多月舌日 早实枳T F L I C E N 同源某【大】的表达分析及功能特征 目录 摘 要I A B S T R A C T I I I 缩略词表V 1 前言1 1 1 问题的提出l 1 2 植物成花诱导综述2 1 2 1 成花诱导概述2 1 2 2 光周期途径3 1 2 3 春化途径7 1 2 4 自主途径9 1 2 5 赤霉素途径1 0 1 3 木本植物的童期调控1 l 1 4 本研究的内容和意义1 2 2 材料和方法1 3 2 1 实验材料13 2 1 1 供试植物材料及基因13 2 1 2 供试农杆菌菌株和质粒1
5、3 2 1 3 实验主要试剂和引物。1 4 2 1 4 培养基配方1 4 2 2 实验方法15 2 2 1 早实枳播种15 2 2 2 早实枳各种处理15 2 2 3 早实枳处理材料的采样1 5 2 2 4 各种处理后早实枳叶片总R N A 提取1 5 2 2 5R N A 质量检测16 2 2 6 提取R N A 的纯化16 2 2 7R N A 的反转录16 2 2 8 反转录产物的P C R 检测1 6 2 2 9 尸f 记，和P t T F L 2 的定量分析1 7 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 2 2 1 0 大肠杆菌感受态细胞的制备1 7 2 2 1 1 农杆菌感受态
6、细胞的制备1 7 2 2 1 2 载体的构建1 7 2 2 13 质粒D N A 的提取2 2 2 2 1 4 农杆菌感受态转化一2 2 2 2 15 转化外植体材料的准备2 3 2 2 1 6 农杆菌介导的转化2 3 2 2 16 1 烟草转化实验2 3 2 2 1 6 2 转基因烟草的分子生物学检测2 4 2 2 1 6 3 转基因烟草阳性苗的移栽2 5 2 2 16 4 早实枳转化实验2 5 2 2 1 6 5 转基因早实枳苗的移栽2 6 3 结果与分析2 6 3 1P t T F L l 和P t T F L 2 的序列分析2 6 3 1 1P t T F L l 和P t T F L
7、 2 的全序列分析2 6 3 1 2T F L l 的系统进化树2 7 3 1 3n 豫己J 和P t T F L 2 同源性分析2 7 3 1 4P t 陋已，和A 刀咒2 保守位点分析2 8 3 2P t T F L l 和P t T F L 2 的表达模式3 0 3 3A 陋己J 和P t T F L 2 的转化实验3 2 3 3 1 载体构建的P C R 及酶切检测。3 2 3 3 2 农杆菌中目的基因的检测3 2 3 3 3 T a b a c u mL i n n 的叶片对H y g B 的敏感性3 3 3 3 4 n u d i c a u l P s 的根对H y g B 的敏
8、感性3 4 3 3 5 转基因n u d i c a u l i s 的P C R 检测3 5 3 3 6 转基因n u d i c a u l i s 的R T - P C R 检测3 6 3 3 7 转基因n u d i c a u l i s 的表型分析3 7 3 3 8 转基因t a b a c u mL i n n 的表型分析3 8 3 3 9 早实枳对H y g B 的敏感性实验3 9 3 3 1 0 早实枳的生根及微芽嫁接4 0 4 讨论4 0 早实枳T F L I C E N 同源基冈的表达分析及功能特征 4 1P t T F L l 和P t T F L 2 在进化上具有高度
9、保守性4 0 4 2P t T F L l 和P t T F L 2 基因的表达模式4 l 4 3 烟草对H y g B 的敏感性4 1 4 4 转化P t T F L l 和P t T F L 2 两种烟草的T o 代植株表型明显4 2 4 5 实验过程中出现的问题及解决方法4 3 4 6 本研究可以开展的下一步工作4 4 参考文献4 5 致谢5 6 早实枳T F L I C E N 旧源幕冈的表达分析及功能特征 捅要 童期的发育机理一直是木本植物育种进程中备受瞩目的问题，尤其是对一些具 有重要经济价值的林木和收获果实为目的的果树来说。如何缩短童期进而提高育种 效率，一直是果树分子生物学研究
10、的重要课题。2 0 世纪7 0 年代末在我国宜昌境内 发现的一株早花的枳壳突变体，该突变体在播种后第一年就有2 0 的开花，第三年 全部开花，并且可以在一年内多次开花。与普通枳相比，其童期大大缩短，正是因 为这个特性而被命名为早实枳( p r e c o c i o u st r i f o l i a t eo r a n g e ，P o n c i r u st r i f o l i a t a ( L ) R a f ) 。早实枳短童期阶段的特性为研究木本植物童期发育的分子机理提供了一个宝 贵的材料。 早期的果树成花研究主要集中于生理生化方面，包括环境因子及栽培技术措施 对实生苗成花的影响等，而对果树开花的分子机制及其遗传调控的研究相对较少。 本课题主要对从早实枳中分离的两个控制木本植物童期发育的关键基因( 尸f 刀咒和 P t T F L 2 ) 进行了生物信息学分析，通过实时定量研究了这两个基因在不同环境因子 影响下的响应，并通过在不同基因型的烟草中表达进行功能验证。研究主要结果如 下： 1 通过生物信息学分析发现，在尸f 刀琵J 和P t T F L 2 的全长序列内都存在4 个外 显子和3 个内含子，均编码一个1 7 3 个氨基酸读码框，预测的分子量分别为1 9 5 k D a 和1 9 2 k D
