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1、南方医科大学2 0 0 7 级硕士学位论文 I L 一6 预处理上调P H B 表达保护H 2 0 ：致心肌细胞损伤作用机制 P r e t r e a t m e n tw i t hI L 一6p r o t e c t sc a r d i o m y o c y t e sf r o m c y t o t o x c i t yi n d u c e db yH 2 0 2t h r o u g hi n c r e a s i n g t h el e v e lo f P H B 课题来源：国家自然科学基金( N O ：3 0 5 7 2 4 3 5 ) 专 业 名称 学位申请人
2、 指 导教师 答辩委员会主席 答辩委员会成员 中西医结合基础 周凤华 贾钰华教授 赖新生教授 杨钦河教授 吴智兵教授 刘晓伟教授 陈达理教授 论文评阅人磊磊互夏衷 吴智兵教授 孙学刚副研究员 2 0 10 年月 日 【 硕士学位论文 I L 6 预处理上调P H B 表达保护H 2 0 2 致, b f l l l 细胞损伤作用机制 硕士研究生：周风华 指导老师：贾钰华教授 摘要 一、目的 近年来，国内外大量研究文献都表明氧化应激是许多病理因素造成心血管 损伤的共同机制，在许多心血管疾病的病理过程中都有过量氧自由基产生，同时 抗氧自由基防御机制却受到抑制，如动脉粥样硬化( A S ) 、高血压
3、病、缺血性心 脏病、高脂血症等。氧化应激损伤心肌细胞的转归与氧化应激的程度相关，在一 定应激强度范围内，氧化应激对心肌细胞造成的损伤是可逆的，而超过一定限度， 则对心肌细胞造成不可逆的损伤，主要包括心肌细胞的凋亡和坏死。 P r o h i b i t i n 又称抗增殖蛋白，最初发现于1 9 9 1 年，是核基因编码的蛋白质， 主要存在于线粒体和细胞核内。近期的研究发现，p r o h i b i t i n 蛋白参与了心肌I R 及氧化应激的病理过程，并且其在氧化应激过程中通过稳定线粒体结构，维持 线粒体内膜完整性从而发挥其减少心肌细胞凋亡，保护心肌细胞的作用。并且， 还有学者通过在肠上皮
4、细胞中的研究发现，I L 6 可能是p r o h i b i t i n 蛋白的上游调 控因子，通过转录信号转导子与激活子( s i g n a lt r a n s d u c e ra n d a c t i v a t o ro f t r a n s c r i p t i o n3 ，S T A T 3 ) 这条细胞信号通路实现对其表达调控。 因此，我们推测在体外培养的心肌细胞中，给予一定量的I L 6 预处理也可能 通过增加p r o h i b i t i n 的表达减轻H 2 0 2 导致的心肌细胞氧化应激损伤。因此，我们 拟采用在币常体外培养的乳鼠心肌细胞中加入一定量的I
5、L 6 干预，通过实时荧光 定量P C R 法及W e s t e r nb l o t 法检验心肌细胞q b p r o h i b i t i nm R N A 及蛋白的表达情 况。通过S i R N A 干扰技术( s m a l li n t e r f e r i n gR N A ，S i R N A ) 沉默p r o h i b i t i n 基因， 中文摘要 检测氧化应激心肌细胞活力及凋亡等情况，以便进一步明确p r o h i b i t i n 蛋白在氧化 应激心肌细胞中的作用，初步探讨I L 6 预处理保护氧化应激心肌细胞损伤的部分 分子机制。 二、方法 1 乳鼠心肌
6、细胞的原代培养参照P a u lS i m p s o n 方法稍加改进，外科无菌 条件下取出乳鼠心脏，用胰酶逐步消化法分离单个心肌细胞，接种至培养瓶中， 采取差速贴壁分离法以去除心肌成纤维细胞，得到纯度较高的心肌细胞用于实 验。 2 H ：0 ：致心肌细胞氧化应激模型建立心肌细胞正常培养3 天后，选取细胞 密度在9 5 以上的，自律性搏动1 2 0 1 4 0 次m i n 的心肌细胞用于实验，选取不 同浓度与时I 日J 点的H ：O ：干预心肌细胞，选择合适的浓度及干预时间用于后面的 实验。 3 M T T 比色法测定心肌细胞活力将心肌细胞接种于九十六孔板，按实验 分组给予相应的处理因素后
7、，按M T T 法具体操作步骤进行处理，在酶标仪4 9 0 n m 处测其O D 值并计算各组心肌细胞存活率。 4 流式细胞仪( F C M ) 检测心肌细胞凋亡率心肌细胞按照实验分组处理 后，用不含E D T A 的胰酶消化收集，以A n n e x i nV - F I T C P r o p i d i u mI o d i d e 进 行染色，室温、避光、反应5 一- - 1 5 m i n ，再上流式细胞仪( 激发波长4 8 8 n m ，发射 波长5 3 0 h m ) 进行检测。 5 凋亡细胞形念学观察心肌细胞按实验分组处理后，按照H e o c h s t 3 3 3 4 2
8、P I 双染试剂盒说明说进行染色，在倒置荧光显微镜下观察凋亡细胞及 坏死细胞形态并拍照。H e o c h s t3 3 3 4 2 产生兰色荧光，P I 产生红色荧光。 6 心肌细胞G S H 的检测将心肌细胞接种于六孔培养板中，实验分为正常 对照组、H ：0 ：组、I L 一6 预处理+ H ：0 ：组，其中I L 一6 预处理的浓度分别为l 、5 、 l O 、5 0 、l O O n g m L 共7 组，处理完毕后，按照谷胱甘肽G S H ( 除蛋白) 检测试 剂盒说明书进行操作，在酶标仪4 2 0 n m 处测量每组O D 值并计算各组细胞内G S H 硕士学位论文 的含量。实验重
9、复三次以上。计算公式：G S H 含量( g G S H L ) = ( 测定管吸光度 一空白管吸光度) 标准管浓度( 2 0 “m o l L ) G S H 分子量( 3 0 7 ) X 稀释倍数 ( 标准管吸光度一空白管吸光度) 。 7 S i R N A 沉默心肌细胞P H B 基因调合适的细胞浓度分别接种于六孔板或 九十六孔板中，正常培养3 天左右，当贴璧细胞达到8 0 - - 9 0 融合时，取细胞 进行实验。实验共分为6 组：J 下常对照组、H ：0 ：组、H z 眈+ I L - 6 组、H 。0 ：+ I L - 6 + 阴性转染组、S i R N A 转染组和H ：0 ：+
10、 I L - 6 + S i R N A 转染组。具体方法见S a n t aC r u z S i R N A 转染试剂盒说明。转染心肌细胞4 8 7 2 h 后收集细胞，再进行W e s t e r n b l o t 实验和M T T 检测心肌细胞活力。 8 实时定量P C R 检测心肌细胞内P H Bm R N A 的表达心肌细胞按照2 X1 0 7 孔的浓度接种至六孔板中，取诈常培养3 天后状态最佳的心肌细胞用于实验。 实验分组依次为：正常对照组、I L 一6l 、5 、1 0 、5 0 、1 0 0n g m L 五个浓度组， I L - 6 干预心肌细胞8 h 后，用T r iz
11、 o l 提取心肌细胞总R N A ，在紫外分光光度计 上测定O D 2 6 0 O D 2 8 0 ，鉴定提取的R N A 纯度和浓度。然后，反转录合成c D N A ， 根据G e n eB a n k 中P H B 、G A P D H 的基因序列资料，借助于计算机软件 P r i m e r P r e m i e r 5 0 设计引物，上机进行目的基因的荧光定量检测。 9 W e s t e r nb l o t 法检测心肌细胞P H B 蛋白的表达心肌细胞按实验分组 处理完成后，以W e s t e r n 及I P 细胞裂解液提取心肌细胞蛋白，B C A 法进行蛋 白定量，进行蛋
12、白印迹实验。以G A P D H 为内参，将处理好的蛋白质样品进行 S D S P A G E 分离，电泳结束后将蛋白质转移到P V D F 膜上，封闭后，孵育一抗和 二抗，E C L 显色，K O D A KI m a g eS t a t i o n2 0 0 0 M M 成像系统采集图像，获得图像 用图像处理软件I m a g eT o o l3 0 测定并分析条带灰度值以检测P H B 的表达水 平。 三、结果 1 H ：O ：能明显抑制心肌细胞活力 1 1H ：O ：对心肌细胞损伤的浓度效应关系M T T 比色法检测不同浓度H ：0 ：干预心 中文摘要 肌细胞3 h 后，细胞活力明显
13、降低，光镜下可看到细胞搏动减弱甚至停止，细胞 密集区域出现大片细胞脱落。与J 下常对照组比较，H ：O ：干预的各组细胞活力均有 所下降，经统计分析各组差异均有统计学意义( F = 8 8 3 0 5 0 ，P O 0 0 0 1 ) ，且随着 H ：0 ：浓度的增加各组细胞活力出现递减趋势。 1 2H ：0 ：对心肌细胞损伤的时间效应关系选取2 0 0 w n o l L 的H ：0 ：分别干预 细胞0 5 h 、1 h 、2 h 、3 h 及6 h ，用M T T 法测细胞活力，处理同上。经统计分析， 各组差异均有统计学意义( F = 5 5 4 6 5 4 ，P O 0 0 0 1 )
14、。 2 I L 一6 预处理可显著减轻H ：0 ：致心肌细胞损伤 2 1I L 一6 预处理可增加心肌细胞活力 通过M T T 检测细胞活力发现，除 I L 一6l O O n g m L 组外，I L 一6 其余浓度组预处理心肌细胞8 h 后再给予2 0 0 1 J I n o l L 的H 2 0 ：3 h ，细胞活力比模型组有所增加，差异有统计学意义( P O 0 0 0 1 ) 。其中， I L 一65 n g m L 组的细胞存活率增加更为明显。光镜下可看到细胞搏动快速有力， 律齐，偶见细胞脱落。但与正常组比较，I L 一6 各浓度组心肌细胞活力均有明显 差异( P O 0 0 0
15、1 ) 。 硕士学位论文 组心肌细胞内G S H 的表达最高。然而，随着I L 一6 浓度的增加，细胞内G S H 的表 达水平出现下降的趋势，1 0 0 n g m L 的I L 一6 预处理组的细胞G S H 的表达水平与 模型组相比，差异无统计学意义( P = 0 4 5 9 ) 。 4 I L - 6 明显上调心肌细胞内P H B 的表达参考文献浓度，我们分别选用 了浓度为l 、5 、1 0 、5 0 、1 0 0 n g m L 的I L 一6 干预心肌细胞8 h ( 干预时间由预实 验摸索得出) 。应用实时荧光定量P C R 的方法检测I L - 6 干预8 h 后心肌细胞内 P
16、H Bm R N A 的表达时发现，I L - 6 干预后的心肌细胞P H Bm R N A 的表达有所增加， 其中I L - 6l n g m L 组与正常对照组相比，差异无统计学意义( P = 0 0 5 6 ) ；其余各 浓度组与正常对照组相比，差异均有统计学意义( P ( O 0 0 0 1 ) ，尤其是I L - 6 5 n g m L 组P H Bm R N A 的水平增加最明显；随着I L - 6 浓度的增加，心肌细胞P H B m R N A 表达水平有所降低，但仍高于正常对照组。应用W e s t e r nb lo t 法检测IL - 6 干预8 h 后心肌细胞内P H B 的蛋白水平发现，I L - 6 干预后的心肌细胞P H B 蛋白 表达增高，其增高的趋势与实时荧光定量P C R 检测出的P H Bm R N A 增高趋势一致， 经统计软件分析，各组差异有统计学意义( F = 3 6 1
