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1、 1 手性高效液相色谱法对佐米曲坦体外立体选择性代谢研究 余露山姚彤炜曾苏 (浙江大学药学院药物分析与药物代谢研究室) 佐米曲坦Zomig311C90是一种新型的 5-羟色胺1B/1D受体激动药物用于急性偏头痛和血管性 头痛的治疗1 2 实验发现佐米曲坦在人肝细胞和鼠肝微粒体中都受细胞色素 P4501A2CYP1A2 介导代谢其经人肝细胞代谢后生成三种代谢产物然而经鼠肝微粒体代谢后只生成一种代谢产物它 们的共同代谢产物是 N-去甲基佐米曲坦实验发现N-去甲基佐米曲坦有更强的 5-羟色胺受体激动活性 34 临床上许多手性药物对映体表现出不同的临床作用比如氧氟沙星5普萘洛尔6布洛芬7 等所以现在一
2、些国家和地区如美国欧盟中国和日本的药品管理权威机构要求手性药物只有活性 单体才能被用做药物上市佐米曲坦就是其中的一种药物它具有两个对映体临床上给药的只是其 S-对映异构体但是目前没有对 R-佐米曲坦研究的相关报道如其药效学药动学代谢过程和药 物相互作用等虽然临床上只用 S-佐米曲坦但 R-佐米曲坦作为对映体杂质不可避免地存在于药物制 剂中残留的 R-佐米曲坦可能会影响 S-佐米曲坦的药效药动学和代谢过程的改变导致临床作用的 改变 至今为止对佐米曲坦的分析测定一般采用反相高效液相色谱的方法348还没有同时测定 佐米曲坦对映体的手性拆分方法报道为了研究 R-佐米曲坦的体外代谢情况以及佐米曲坦两对映
3、体间 的相互作用本文建立了鼠肝微粒体中佐米曲坦的手性分析方法同时利用建立的方法研究了佐米曲 坦的体外代谢以及对映体间相互作用 1 2 仪器与试药 岛津 LC-10A 系列高效液相色谱仪包括 LC-10AT 双泵SPD-10AV 荧光检测器CTO-10A 柱温 箱HPLC-ESI-MS 色谱仪Aglient 1100 系列佐米曲坦消旋体和其两个光学异构体98%HPLC 由浙江大学化学系赠送地非三唑由浙江大学药学院药物化学教研室赠送-萘黄酮枸橼酸三钠盐 枸橼酸脱氢酶氧化还原型辅酶N A D P / N A D P H购于 S i g m a公司正己烷和异丙醇购于天地公司 其它试剂都为国产分析纯 3
4、 实验方法 2.1 色谱条件 分析柱 Chiralpak AD-H 柱 250mm4.6mm 5m流动相正己烷/异丙醇/三乙胺 72/28/0.25 v/v/v流速1.0ml/min柱温30激发波长 ex291nm 荧光波长 em350nm 进样量20L 2 2.2 微粒体制备 取 Sprague-Davey 雄性大鼠 170-210g6-7 周以-萘黄酮为诱导剂按文献方法诱导制备微 粒体和测定微粒体蛋白质浓度910-萘黄酮主要诱导细胞色素 P450 1A2CYP1A2微粒体贮藏 在-80保存 2.3 体外孵育反应 取微粒体适量 分别加枸橼酸再生系统溶液 0.1 mol L-1 Tris-HC
5、l缓冲液, pH7.4, 15m mol L-1 MgCl2, 12m molL-1枸橼酸0.38 单位的枸橼酸脱氢酶和不同浓度的底物适量体系终体积为 0.5ml微粒 体蛋白质终浓度为 0.75mgmL-1 37预孵育 5min加 5L NADP/NADPH0.172 molL-1 NADP 和 0.018 mol L-1 NADPH 启动反应 孵育一定时间后加 6% HClO4 70L 终止反应 加内标 1mg mL-1 地非三唑甲醇溶液5L 和 10L 5 molL-1NaOH 溶液用氯仿/异丙醇75/25的混合溶液 2mL 提 取旋涡 2min3000rmin-1 离心 10min 取有
6、机层空气下挥干用 200L 流动相溶解残渣取 20 L 进样测定剩余底物浓度 2.4 数据处理 所有数据结果都以 meanS.D.表示结果差异比较以 t 检验表示利用 SAS 统计软件 p0.05 表示有显著性差异p3 3 3.1.3 精密度实验 取空白微粒体适量酶蛋白终浓度为 0.75mgmL-1 按标准曲线项下制备 R-和 S-佐米曲坦 低中高三个浓度0.21.05.0gmL-1的样品按上述 体外孵育过程处理样品后每一 浓度进行 5 次样本分析计算各对映体与内标峰面积比值并代入标准曲线求出各对映体浓度分别 进行日内及日间精密度考察结果见表 1日内和日间精密度偏差都在 10%以内 3.1.4
7、 回收率实验 回收率实验考察操作同精密度实验项下代入标准曲线中计算得到的样品浓度与实际加入样品 浓度比值作为回收率值结果见表 1低中和高三个浓度的平均回收率为 101.5%本实验中有机提取 溶剂氯仿/异丙醇75/25v/v的选择参照我们以前的实验条件在此实验条件下底物和内标的回 收率都较好 以上结果说明本实验方法专属准确灵敏能用于鼠肝微粒体中佐米曲坦的立体选择性代谢研 究 3.2 体外代谢研究 3.2.1 时间依赖性代谢实验 取诱导鼠肝微粒体适量终浓度 0.75mg 蛋白mL-1以 RS-佐米曲坦2.0gmL-1或佐米曲 坦单一对映体1.0gmL-1为底物分别孵育 510 和 20min后剩余
8、操作按体外孵育过程项 下当佐米曲坦消旋体体外孵育 510 和 20min 后S-和 R-佐米曲坦被鼠肝微粒体代谢的量呈显著性 差异 它们的比值分别为 2.6 2.7 和 3.1 比值呈上升趋势 佐米曲坦单一对映体体外孵育 5 10 和 20min 后S-和 R-佐米曲坦被鼠肝微粒体代谢的量也呈显著性差异它们的比值分别为 2.52.4 和 2.4比值 基本相同以上结果表明佐米曲坦两对映体受鼠肝微粒体酶CYP1A2代谢速度呈显著性差异相 同条件下S-佐米曲坦受鼠肝微粒体酶代谢的速度快于 R-佐米曲坦 临床上佐米曲坦以其 S-对映体给药但是没有文献报道其原因Seaber 等发现 N-去甲基佐米曲 坦
9、具有更强的 5-HT1D受体激动活性并且治疗效果随其血浆浓度的增加而增加11 虽然以诱导鼠肝微 粒体为酶介质的药物体外代谢结果并不能代替药物在人体内的代谢结果 但许多文献报道其确实是一种 很好的研究药物体外代谢的模型12-16S-佐米曲坦代谢速度明显快于 R-对映体可能是临床上只以 S- 对映体给药的原因之一 3.2.2 对映体间相互作用实验IC50 取诱导鼠肝微粒体适量 终浓度 0.75mg蛋白 mL-1分别以 R-或 S-佐米曲坦为底物 0.8g mL-1 当测定 R-对 S-对映体代谢 IC50IC50R/S时R-佐米曲坦的浓度范围为 0 到 40gmL-1当测定 S- 对 R-对映体代
10、谢 IC50S/R时 S-佐米曲坦的浓度范围为 0 到 2.0g mL-1孵育时间为 10min 结果 IC50R/S 为 4.970 . 2 3 gmL-1IC50S/R为 0.110 . 0 1 gmL-1它们的比值为 45.2具有极显著性差异说 4 明 S-佐米曲坦对 R-佐米曲坦的代谢具有明显的抑制作用而 R-佐米曲坦对 S-佐米曲坦的代谢抑制作用 较弱药物制剂中对映体杂质量较低体外实验结果表明S-佐米曲坦中残留的微量 R-佐米曲坦并 不会引起 S-佐米曲坦代谢的改变 Table 1. Recovery and precision for assay of R- and S-zolmi
11、triptan in rat hepatic microsomes incubates (meanRSD, n=5) Conc. Spiked Recovery (%) Relative standard deviations (%) (gmL-1) R- S- Intra-day Inter-day R- S- R- S- 0.2 107.27.2 108.23.3 7.4 3.3 5.6 7.0 1.0 95.21.6 97.93.5 1.6 3.5 4.0 5.2 5.0 100.26.1 100.16.8 6.1 6.8 6.3 3.5 参考文献 1 G.R. Martin (Edit
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