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1、上海交通大学 硕士学位论文 果蝇肿瘤抑制基因scrib突变体表型的发育动态分析及蛋白质磷 酸化的研究 姓名：陈励 申请学位级别：硕士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：李明发 20070101 果蝇肿瘤抑制基因 scrib 突变体表型的发育动态分析及蛋白质磷酸化的研究 2 上海交通大学上海交通大学 学位论文原创性声明学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得 的成果。 除文中已经注明引用的内容外， 本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或 撰写过的作品成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体， 均已在文中以明确方式 标明。本人完全意
2、识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：陈励 日期： 2007 年 1 月 25 日 果蝇肿瘤抑制基因 scrib 突变体表型的发育动态分析及蛋白质磷酸化的研究 3 上海交通大学上海交通大学 学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、 使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。 本人授权上海交 通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密保密，在 年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密 不
3、保密。 （请在以上方框内打“” ） 学位论文作者签名：陈励 指导教师签名：李明发 日期： 2007 年 1 月 25 日 日期：2007 年 1 月 25 日 果蝇肿瘤抑制基因 scrib 突变体表型的发育动态分析及蛋白质磷酸化的研究 4 果蝇肿瘤抑制基因果蝇肿瘤抑制基因 scrib 突变体表型的发育动态分析突变体表型的发育动态分析 及蛋白质磷酸化的研究及蛋白质磷酸化的研究 摘 要 果蝇 scrib 基因作为 nTSGs 的一员，在细胞极性与增殖的调控中 发挥重要的作用。scrib1 是 scrib 的一种致死突变等位基因。已知其 纯合子只能存活到三龄幼虫晚期，并且幼虫的整个生长周期都会延 长
4、，成虫盘增大融合，上皮单层细胞结构被破坏，细胞极性丧失。我 们动态观察 scrib 纯合突变幼虫在发育过程中的形态变化，对其幼虫 翅成虫盘组织进行细胞计数和免疫荧光染色， 观测翅成虫盘整体结构 变化和极性丧失，以及细胞形状和数量的改变，以此确定上皮细胞极 性丧失与过度增殖在 scrib 突变体中发生的前后顺序以及可能的内在 联系。另外我们在体外克隆表达了 scrib 截短序列，构建 GST 融合蛋 白后进行了体外激酶试验，希望可以找到 aPKC 磷酸化位点，以研究 Scrib 调控上皮极性的可能机制。 关键词： scrib，极性，细胞增殖，aPKC，磷酸化 果蝇肿瘤抑制基因 scrib 突变体
5、表型的发育动态分析及蛋白质磷酸化的研究 5 PHENOTYPIC CHARACTERIZATION OF DROSOPHILA TUMOR SUPPRESSOR GENE SCRIB MUTANT IN DEVELOPING LARVAE AND PHOSPHORYLATION STUDIES OF SCRIB ABSTRACT As one of the neoplastic tumor suppressor genes (nTSGs), Drosophila scrib plays a critical role in the regulation of cell polarity and
6、 proliferation. scrib1 is one lethal allele: whose homozygotes lose the ability to organize an epithelial monolayer and have overproliferated imaginal discs, dying as giant larvae after an extended third instar stage. To clarify the relationship between cell polarity and proliferation in scrib mutan
7、t, we used cell number counting and immunofluorescence staining to dynamically observe the morphgenesis of the developing scrib larvae, the disrupting course of the epithelial architecture and the change of the cell number in their wing disc. In addition, we cloned and expressed the truncated scrib
8、DNA sequences in vitro, and then constructed GST fusion proteins. We hope we could identify the aPKC phosphorylation sites in Drosophila Scrib by in vitro kinase assay, in order to study the mechanism of scirb regulate the polarity and proliferation. KEW WORDS: scrib, polarity, cell proliferation, a
9、PKC, phosphorylation 果蝇肿瘤抑制基因 scrib 突变体表型的发育动态分析及蛋白质磷酸化的研究 8 第一部分 果蝇肿瘤抑制基因 scrib 突变体表型的 发育动态分析 第一章 前 言 11 模式生物果蝇 黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）在分类学上属于昆虫纲双翅目。其中 Drosophila 是属名，拉丁文的意思是喜欢露水，它的种名 melanogaster 是黑色消 化道的意思。在这类果蝇的幼虫腹部一侧可见到黑色的消化道，由此称之为黑腹 果蝇。 黑腹果蝇即是我们常说的果蝇， 它起源于中非， 现在广泛分布于温暖地区。 果蝇的生活周期包括卵、幼虫、蛹
10、和成虫四个完全变态的发育阶段，其中幼 虫又分为一龄(L1)、二龄(L2)及三龄(L3)3 个时期（图 1-1） 。从初生卵发育至新 羽化的成虫为一个完整的发育周期，在 25，60相对湿度条件下，大约为 10 天。通过控制养殖的温度，可以加速和减缓果蝇的发育。果蝇个体很小，幼虫在 三龄时达到最大，约 5 毫米，成年果蝇也仅为 23 毫米。新羽化的雌性成虫大 约 8 小时之后即可进行交配，交配之后大约 40 小时开始产卵，第 4-5 天出现产 卵高峰。性成熟雌性果蝇生殖能力很强，产卵初期每天可达 5070 枚，累计产 卵可达上千枚。 图 1-1 果蝇的生活周期 Figure 1-1 Life cy
11、cle of Drosophila 果蝇肿瘤抑制基因 scrib 突变体表型的发育动态分析及蛋白质磷酸化的研究 9 近一百年前，摩尔根发现了著名的白眼果蝇，使基因与染色体的关系得以确 立，遗传学因此迈出了关键的一步1。此后，果蝇作为最理想的模式生物之一， 对遗传学、发育的基因调控、各类疾病的研究等作出了重要贡献。 果蝇作为理想的模式生物具有以下的优点： 1果蝇的饲养条件很简单，对环境的要求非常低。果蝇的体型很小，可以在实 验室大规模饲养。 2生命周期短。在 25，果蝇 10 天即可完成一个生活周期。生殖能力强。每 只雌蝇在生殖高峰期一般每天产卵约 70 枚。在其一生中，一般为 7001000
12、枚，最高可产卵 3000 枚。雄蝇一生可有一万到一万四千多个后代。这两个优 点使得果蝇非常有利于进行遗传筛选。 3在雄性果蝇中不会发生染色体的同源重组。 4果蝇只有 4 对染色体，基因组大小仅为 180Mb，只有大约 13600 个基因2。 果蝇幼虫唾液腺具有巨大的多线染色体，能够直接观察，这便于染色体畸变 的观察和基因的染色体定位。 5果蝇的刚毛、翅膀、复眼等外骨骼结构易受基因突变的影响而产生表型变化 3。这些表型可以在显微镜下方便地观察。 6果蝇和脊椎动物的许多生长发育过程是保守的。人类大约 80的基因在果蝇 中都有同源基因。有 50的果蝇蛋白序列与哺乳动物蛋白有相似性3。 7果蝇与哺乳动
13、物的相似性不仅体现在诸如转录因子、结构蛋白、信号蛋白等， 还牵扯到更复杂的机制诸如发育、行为、生理反应等等。 黑腹果蝇是是最普遍应用于遗传学的果蝇， 也是奠定经典遗传学基础的重要 模式生物之一，作为研究历史悠久的生物，果蝇有着深厚的遗传背景，对其染色 体组成和表型、基因编码和定位的认识，是其它生物无法比拟的。基于清晰的遗 传背景和便捷的遗传操作，果蝇在发育生物学、生物化学、分子生物学等领域也 都占据了不可替代的位置。总之，果蝇在近一个世纪以来的生物学舞台上占有举 足轻重的地位，在各个领域的广泛应用使其成为一种理想的模式生物，不论在已 往、现在和将来，都为人类探索生命科学的真谛做出不可磨灭的贡献
14、。 12 癌性肿瘤抑制基因（nTSGs） 近年来，人们在对果蝇遗传分析的过程中，发现了一组与细胞极性和增殖调 控相关的基因lethal giant larvae (lgl)、discs large (dlg)、scribble (scrib)。其中 果蝇肿瘤抑制基因 scrib 突变体表型的发育动态分析及蛋白质磷酸化的研究 10 任一基因的失活突变都会导致果蝇胚胎上皮、成虫盘上皮、卵泡细胞等上皮细胞 极性的丧失，细胞过度增殖，不分化，细胞黏附性下降，迁移与侵袭能力增强， 上皮组织结构破坏，组织过度生长等类似人类癌性肿瘤的表型4，因而它们被称 为癌性肿瘤抑制基因(neoplastic tumor
15、 suppressor genes, nTSGs)。nTSGs 的突变表 型提示它们在调节果蝇上皮细胞的极性与增殖方面具有重要的作用。不仅如此， 研究表明，它们还和其他相关基因一起参与到果蝇神经母细胞的不对称分裂5-7 以及神经突触的塑造8等其他极性过程之中。此外，nTSGs 的功能也并不仅仅局 限于果蝇， 它们在不同物种间高度保守的同源基因很可能同样行使着调节细胞极 性与增殖的保守功能9。因此，研究 nTSGs 的功能以及 nTSGs 与其他基因间的 相互作用对于阐明细胞极性与增殖的调控机制具有十分重要的意义。 13 scrib 概况 果蝇的scrib基因一共有3个不同的转录本，分别长7.2, 6.0和4.6kb。它们有共 同的5端，但是3端不同。7.2kb和6.0kb的转录本只是3端的UTR不同，开放阅读 框都含有5268个碱基，编码长1756个氨基酸残基的蛋白质产物。这两个转录本都 被确定为Scrib1 （我们通常所说的Scrib） 。 选择性剪切的长4.6kb的转录本编码1247 个氨基酸残基的蛋白，被定义为Scrib2，其为截短形式（图1-2）10。在早期胚胎 形成阶段，两种形式都广泛表达，而在形态发生阶段，Scrib1主要在中央神经系 统表
