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1、中国农业科学研究院 硕士学位论文 猪Pit-1基因分子遗传多态性研究 姓名：庞瑾 申请学位级别：硕士 专业：动物遗传育种与繁殖 指导教师：郑友民 20040501 猪P i t 一1 基因分子遗传多态性研究 摘要 催乳素( P r o l a c t i n ，P R L ) 、生陡激素( G r o w t hH o r m o n e ，G H ) 、促甲状腺素( T h y r o i d s t i m u l a t i n g I I o r m o n e ，T S t t ) 是动物垂体前叶分泌的具有重要生理功能的激素。而垂体特异性转录因子 ( P i t u i t a r
2、y S p e c i f i cT r a n s c r i p t i o nF a c t o r ) P i t - 1 则是动物垂体前叶特异表达的一种具有重要功能的 转录因子，它与垂体中P R L 基因、G H 基因、T S H 基因以及P i t - I 自身的启动子结合，调控这些 基因的转录和表达，从而影响动物的生长、发育和繁殖。 本研究的目的是通过分子生物技术手段，寻找猪P i t ，1 基因序列中的多态位点，为后续深入 研究提供理论依据。试验选用北京黑猪、沂蒙黑猪、莱芜猪、巴马小型猪、滇南小耳猪、五指山 猪、香猪7 个中国地方猪品种以及英系大白猪、长白猪、法系大白猪、杜洛克
3、4 个国外引入品种 ( 系) 共I1 个试验动物群体5 0 8 头个体。采用P C R S S C P 和P C R - R F L P 分析方法研究猪P i t - 1 基 因的遗传变异，研究结果如下： 1 应用P C R S S C P 技术，利用引物P I ，在7 个中国地方猪种P i t - 1 基因第4 外显子上发现 了一个突变位点。序列测定结果表明，其单核苷酸变异是由碱基c T 的替换造成的，但并没有 导致编码氨基酸的改变，均编码组氨酸。对7 个中国地方猪群体其计3 4 7 头个体的基因型进行了 检测与统计分析，H a Z y W e i n b e r g 平衡适台性检验结果表明
4、：在这7 个群体中，沂蒙黑猪、巴马 小型猪群体的基因频率和基因型频率都处于平衡状态( P O 0 5 ) ，而北京黑猪、莱芜猪、滇南小 耳猪、五指山猪、香猪群体则未达到平衡状态( P 0 0 5 ) ，而长白猪和法 系大白猪群体未处于平衡状态( P 0 0 s ) ，t h eo t h e rf i v eC h i n e s el o c a lb r e e d sw e r ei nd i s e q u i l i b r i u m ( P O 0 5 ) L a i w up i ga n d W u z h l s h a n p i gh a d l o wp o l y
5、m o r p h i s m ( P l C O 2 5 ) ，B e i j i n gB l a c kp i g ，Y i m e n g B l a c k p i g ，B a m a S m a l lp i g ， D i a n n a nS m a l l e a rp i ga n dX i a n g p i gh a di n t e r m e d i a t ep o l y m o r p h i s m ( O 2 5 P I C O 0 5 ) ，L a n d r a c e a n d L a r g eW h i t e ( F r a n c e )
6、 w e r e i n d i s e q L l i l i b r i u m ( P O 0 5 ) A l lo f t h e s ef o u rf o r e i g nb r e e d sh a di n t e r m e d i a t ep o l y m o r p h i s m ( O ，2 5 P I C O 5 为高度多态，0 2 5 P I C O 5 为中度多态，P I C 0 2 5 为低度多态。 P 1 C = 1 一p 卜2 p ，2 p ； _ 1 l = l ，= 1 + 1 P i 和P J 分别为第i 和第j 个等位基因在群体中的频率，m
7、为等位基因数。 三、结果与分析 2 31 1 个品种( 系) 猪的基因组D N A 提取 图2 1 为从血液中提取的基因组D N A ，在0 8 的琼脂糖凝胶中的电泳图谱。 图2 1 猪血液基因组D N A F i 9 21G e n o m i c D N A e x t r a c t e d f i o m b l o o d M ：k - D N M H i n d I I I d i g e s t 图2 2 为从耳组织中提取的基因组D N A ，在0 8 的琼脂糖凝胶中的电泳图谱。 图2 2 猪耳组织基因组D N A F i 9 22G c m o n i cD N A e x t
8、 r a c t e df r o me a rt i s s u e s M ： - D N A H i n d I I Id i g e s t 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪P i t 1 基因分子遗传多态性研究 从以上的电泳检测图谱可以看出，基因组的大小约在5 0 K b 以上，且提取的基因组D N A 几乎 没有托尾现象。经检测所提取的D N A 浓度大约为5 0 0 n g l a l ，由此说明D N A 浓度和纯度完全符合 要求，可直接用于P C R 扩增反应。 2 4 猪P i t - 1 基因第4 外显子的P C R - S S C P 分析及其克隆测序结果 2 4 1
9、P C R 扩增结果 图2 3 用引物P ，扩增外显子4 ，其片段大小为1 5 9 b p l 6 ：不同个体的扩增产物 M ：1 0 0 b p l a d d e r F i 9 2 31 5 9 b pP C Rp r o d u c to f P i t 1g e n ee x o n 4 L a n e l 6 ：I n d i v i d u a l P C R p r o d u c t M ：1 0 0 b pl a d d e r 图2 3 是用引物P 1 对猪P i t - I 基因第4 外显子的扩增结果，从扩增检测结果可见，P C R 产物 的特异性比较好，扩增效率较高，
10、满足进彳亍下一步非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的要求。 2 4 2 猪P i t 。1 基因第4 外显子扩增产物的P C R - S S C P 分析 图2 4 用引物P 对猪P i t - 1 基因第4 外显子1 5 9 b p 片段的P C R - S S C P 分析( 1 2 聚丙烯酰胺凝胶) F i 9 241 2 P A G Ep a R e mo f p o r c i n eP i t - Ig e n ee x 0 1 1 41 5 9 b pf l a g m e n tP C R - S S C Pa n a l y s i s 由图24 可见，共产生了3 种带型，其中把产生了
11、4 条带的带型定位杂合的A B 型，把另外 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪P i t - 1 基因分子遗传多态性研究 两种只产生2 条带的带型分别定位纯合的A A 和B B 型。从试验结果得出，在纯合的类型中，A A 基因型相对较多，而B B 基因型比例较少。 注：此位点的多态性仅在中国地方猪种中表现，而在国井引入猪种( 系) 中则为单态a 2 4 3 阳性克隆鉴定结果 嗤2 5 猪P i t 一1 基因第4 外显子1 5 9 b p 扩增片段的阳性克隆E e o R l 单酶切鉴定图谱 1 ：以阳性克隆质粒D N A 为模板的1 5 9 b pP C R 扩增产物 z ：蓝斑对照阴性克隆
12、质粒D N A 3 ：E c o R l 酶切自斑阳性克隆的质粒D N A 4 ；以猪基因组D N A 为模板的1 5 9 b pP C R 扩增产物 F i 9 2 5I d e n t i f i c a t i o no f1 5 9 b pp o s i t i v ed o n ed i g e s t e dw i t hE c o R I 1 1 5 9 b p P C R p r o d u c tu s i n g p o s i t i v e p l a s m i d D N A a s t e m p l a t e 2 ：P l a s m i dD N Ae x
13、t r a c t e df r o mn e g a t i v ec l o n e 3 ：P l a s m i dD N A e x t r a c t e df r o mp o s i t i v ec l o n ed i g e s t e dw i t hE c o R I 4 ：1 5 9 b p P C R p r o d u c t u s i n g g e n o m i c D N A t e m p l a t e 图2 5 是用聚丙烯酰胺凝胶对1 5 9 b p 大小的猪P i t - 1 基因的第4 外显子阳性克隆质粒的鉴定。 阳性克隆经E c o R I
14、单酶切后，出现了 5 9 b p 的插入片段，同时又以阳性克隆的质粒D N A 为模板 进行P C R 扩增，与基因组D N A 的P C R 扩增出现同样的目的片段。因此，可以证明转化成功。 2 4 4 测序结果 灞隅黼鬻黼箍夔鬻黼ac a a a t g t t g gg g a a g c c c t gg c a g c t g t g c 趣g g c t c t g a a t t c a g t c a a a c g a c t a t t tg c c g a t t t g aa a a c c t a c a gc t c a g c t t c aa a a a t g
15、 c a t g c a a a c t a a a ag c a a t a t t a tc c 螨麟黼澜潮 中国农业科学院硕士学位论文第二章猪P i t 1 基因分子遗传多态性研究 该测序序列为纯合A A 基因型：其中阴影部分分别为5 端上游引物序列和3 端下游引物 序列。加边框的碱基为突变碱基。 2 4 5 序列结果分析 对比P C R - S S C P 的两个纯合基因型的测序结果，确定了变异位点的位置及序列变化。 对猪P i t 一1 基因第4 外显子的两个纯合基因型的序列对比发现：A A 基因型在第5 2 位碱基序 列处产生了一个c T 的突变，而B B 基因型在该碱基序列处无此
16、突变。 此突变使C A C C A T ，但并没有引起氨基酸的变化，编码的均为组氨酸。 2 5 猪P i t - 1 基因第5 内含子的P C R - S S C P 分析及其克隆测序结果 25 1P C R 扩增结果 图2 6 用弓I 物P z 扩增内台子5 ，其片段大小为2 1 8 b p 1 6 ；不同个体的扩增产物 M ：1 0 0 b pl a d d e r F i 9 262 1 8 b pP C Rp r o d u c to f P i t - lg e n ei n t r o n 5 L a n e l 6 ：I n d i v i d u a l P e R p r o d u c t M ：1 0 0 b pl a d d e r 图2 6 是用引物P 2 对猪P i t - I 基因第5 内含子的扩增结果，从扩增检测结果可见，P C R 产物特
