淋球菌外膜蛋白pi基因重组子的构建和表达

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1、四川大学 硕士学位论文 淋球菌外膜蛋白PI基因重组子的构建和表达 姓名：文华 申请学位级别：硕士 专业：营养与食品卫生 指导教师：裴晓方 20040430 四川大学硕士论文淋球菌外膜蛋白P i 基因重组子的构建和表达 题目 淋球菌外膜蛋白p 1 基因重组子的构建和表达 中 文 摘 要 目的: 扩增淋球菌外膜蛋白 P I 抗原基因，构建p B S - T P I N G 克隆重组子， 测定分析 P I 序列; 构建 p E T 3 0 b - P I - N G 重组 子， 在大肠杆菌中 诱导 表达淋 球菌外 膜蛋白 P I . 为后续P I 蛋白免疫学特性的研究、 抗体制备、 以及预防淋病疫苗

2、的研制奠定基础。 方法: 本研究分为三部分:第一部分是淋球菌基因组的提取及外膜蛋白 P I 基因的 P C R 扩增。 提取采集到的四个临床淋球菌菌株细菌基因组， 针对其外膜蛋白 P o r i n I C P I )基因设计特异性引物，P C R 扩增P I 基因;第二部分是淋球菌外膜蛋白P I 基因 的克隆与 P I 基因的 序列分 析。 将目 的 基因 P I 与克隆载体 p B S - T 在连接酶作用 下连接，转化D H 5 a 感受态细胞，抗生素平板、蓝白菌落筛选阳性克隆，质粒抽 提，双酶切鉴定，基因测序，与G e n B a n k 的相应序列进行序列分析比较;第三部 分是淋球菌

3、外膜蛋白P I 基因表达质粒重组子的构建与表达。从重组的克隆质粒 p B S - T - P I 中切取目 的 基因， 插入表达质粒载体p E T 3 0 b 中， 转化D H 5 a 感受态细胞， 抗生素平板筛选阳性重组子， 质粒提取，双酶切和P C R 鉴定，选取鉴定正确的阳 性重组子转化表达宿主大肠杆菌B L 2 1 ( D E 3 ) , I P T G 诱导蛋白 质表达， S D S - P A G E 初步分析。 结果: I . 四株临床淋球菌 分别命名为N G , , N G 2 , N G 3 , N 吼)的基因组经P C R 扩增得到 0 .9 k b - I .O k b

4、范围内的 预期长 度目 的片段， 分别命名为P I N G , , P I N G 2 , P I N G 3 和P I N G a o 2 . 将 P I N G P I N G 2 , P I N G 3 和 P I N G a 分别 插 入 p B S - T 克 隆 质 粒， 构建了 四川大学硕士论文淋球菌外膜蛋白P I 基因重组子的构建和表达 p B S - T P I N G p B S - T - P I N G 2 p B S - T P I N G 3 , p B S - T P I N G 4 重组子， 并 分别 经 E c o R I 和k b o I 双酶 切证实和测

5、序。 序列分 析结果显 示， 所构建的 p B S - T P I N G I , p B S - T P I N G 2 , p B S - T - P I N G 3 和p B S - T P I N G 4 重组质粒， 在P I N G I , P I N G 2 , P I N G 3 和P I N G 4 片段的插入处的接头完全正确， 表明 p B S - T P I N G I , p B S - T - P I N G 2 , p B S -T - P I N G 3 和 p B S - T - P I N G 4 重 组 质 粒 构 建 成 功。 3 . P I N G , ,

6、 P I N G 2 长 度均为 9 0 7 b p ， 编码 3 0 2 个氨基酸: P I N G 3 , P I N G 4 长 度 均为9 7 0 b p ， 编码3 2 3 个氨基酸。 4 . P I N G I , P I N G 2 , P I N G 3 P I N G 4 的 碱基序列、 编 码氨基酸序列分 别与 G e n B a n k 中相应的淋球菌菌株比较显示:P I N G : 与淋病奈瑟菌菌株4 8 0 5 外膜蛋白 I 基因 ( G I : 3 9 2 5 4 9 7 / / A C C E S S I O N : A F 0 9 0 8 1 9 )的碱基有两个

7、位点不同，同源性 达9 9 %，编码的氨基酸有一个位点不同，同源性为9 9 .7 %; P I N G 2 与淋病奈瑟菌 菌株4 8 0 5 外膜蛋白 I 基因 ( G I : 3 9 2 5 4 9 7 / / A C C E S S I O N: A F 0 9 0 8 1 9 )有四个位点 碱基不同， 同源性达9 9 %， 编码的氨基酸序列在三个位点处不同，同源性为9 9 %; P I N G 。 与淋病奈瑟菌菌株S U 1 0 6 外膜蛋白I 基因 ( G I : 1 7 6 3 3 2 9 / / A C C E S S I O N: U 7 5 6 3 9 ) 有两个位点碱基不同，

8、同 源性9 9 %， 编码的氨基酸有两个位点不同， 同 源 性 9 9 % ; P I N G ;与 淋 病 奈 瑟 菌 菌 株 4 1 7 4外 膜 蛋 白 I 基 因 ( G I : 3 9 2 5 4 6 1 / / A C C E S S I O N : A F 0 9 0 8 0 1 ) 有十八个位点碱基不同，同源性为9 8 %, 编码的氨基酸序列有十个位点不同， 同源性为9 7 . 5 %。 四个P I N G 碱基序列之间比 较，有二百三十二个位点不同，同源性为7 4 %;编码的氨基酸序列有一百个位点 处不同，同 源性为6 7 %。进一步比 较发现， P I N G ， 与P I

9、 N G 2 的碱基在两个位点处 不同，同源性高达9 9 . 8 %，编码的氨基酸在两个位点处不同，同源性高达9 9 %; P I N G 3 与P I N G a 在二十个位点处碱基不同，同 源性为 9 8 %，编码的氨基酸在十三 个位点处不同，同源性9 6 %. P I N G i , P I N G Z 与P I N G 3 , P I N G a 可能分别属于P I 的 两种亚型 P I A 和P I B o 5 . 将P I N G i , P I N G Z , P I N G 3 和P I N G ; 分别插入p E T 3 0 b ，构建了 p E T 3 0 b - P I

10、N G p E T 3 0 b - P I N G Z , p E T 3 0 b - P I N G 3 , p E T 3 0 b - P I N G 4 重组子， 并分别经E c o R I 四川大学硕士论文 和X h o I 双酶切和P C R 证实。 淋球菌外膜蛋白P I 基因重组子的构建和表达 6 . 将p E T 3 0 b - P I N G I , p E T 3 0 b - P I N G 2 , p E T 3 0 b - P I N G 3 , p E T 3 0 b - P I N G 4 重组 质粒分别转化表达型宿主B L 2 1 ( D E 3 ) ， 用I P

11、T G 在大肠杆菌中诱导表达淋球菌外 膜蛋白 P I , S D S - P A G E 结果初步显示， p E T 3 0 b - P I N G I , p E T 3 0 b - P I N G 3 , p E T 3 0 6 - P I N G 4 均出 现预期目 的 基因的表达产物: p E T 3 0 b - P I N G 2 I P T G 未见明显的诱导蛋白， 原因有待进一步研究。 结论: 1 . 对四个临床淋球菌菌株的外膜蛋白 P I 基因进行克隆， 成功地构建了P I 基因 的 克 隆 质 粒 重 组 子 p B S - T - P I N G I , p B S - T

12、 - P I N G 2 , p B S - T - P I N G 3 , p B S - T P I N G 4 o 2 . 对p B S - T - P I N G I , p B S - T P I N G 2 , p B S - T P I N G 3 , p B S - T P I N G 4 进行测序， 报道了国内临床分离的4 株淋球菌的外膜蛋白 P I 的基因序列。 与G e n B a n k 中相应淋 球菌的 P I 基因 进行碱基序列和编码氨基酸序列的比 较， 发现P I N G I , P I N G 2 与P I N G 3 , P I N G 4 可能分别属于 P

13、I 的两种亚型 P I A 和P I B . 3 . 成功 地构建了 大肠杆菌表达重组子 p E T 3 0 b - P I N G I , p E T 3 0 b - P I N G 2 , p E T 3 0 b - P I N G 3 , p E T 3 0 b - P I N G 4 1 I P T G 诱导 初 步 证 实 有目 的 蛋白 表达。 综上， 本研究通过克隆和表达四株临床来源的淋球菌外膜蛋白P I 基因， 为今 后对P I 蛋白免疫学特性的研究、 抗体制备莫定了基础;同时也首次报道了四株国 内临床分离淋球菌的P I 基因序列， 对于深入研究定位突变获得能刺激机体产生保 护

14、性免疫反应的外膜蛋白抗原， 提供了有价值的资料， 对预防淋病的基因工程疫 苗的研究具有重要的意义。 关键词:淋 球菌， 外 膜蛋白 P I , p B S - T , p E T 3 0 b , P C R ， 克隆， 测序， 转化。 四川大学硕士论文淋球菌外膜蛋白P I 基因重组子的构建和表达 C o n s t r u c t i o n a n d e x p r e s s i o n o f t h e m a j o r o u t e r m e m b r a n e p r o t e i n P I o f N e i s s e r i a g o n o r r h o

15、 e a e i n E s c h e r i c h i a c o l i ABS TRACT O b j e c t : P o r i n I ( P I ) i s t h e m a j o r o u t e r m e m b r a n e p r o t e i n o f N e is s e r i a g o n o r r h o e a e . I n t h i s r e s e a r c h w e d e s c r ib e d a m e t h o d b y w h i c h t h e g e n e e n c o d i n g P I

16、 w a s c l o n e d i n t o a n e x p r e s s i o n p l a s m i d a n d t h e n P I p r o t e i n w a s e x p r e s s e d in E . c o i l . T h e e x p r e s s e d P I p r o t e in w i l l b e a p p l i e d i n t h e f u rt h e r r e s e a r c h f o r P I a n t i g e n i c i t y a n d i m m u n o l o g ic a l a c t iv i t y . T h i s w i l l b e v e r y h e l p f u l f o r t h e f u rt h e r c o n s t r u c t i o n o f v a c c i n e s f o r p r e v e n t i