《生物样品高通量液相色谱分析方法学研究及其药代动力学应用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物样品高通量液相色谱分析方法学研究及其药代动力学应用（172页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第二军医大学 博士学位论文 生物样品高通量液相色谱分析方法学研究及其药代动力学应用 姓名：闻俊 申请学位级别：博士 专业：药物分析学 指导教师：吴玉田;范国荣 20080501 生物样品高通量液相色谱分析方法学研究及其药代动力学应用 L C M S M S H P L C P P L L E S P E S I 洲 御R 嗄 Q C C 瑚x t 姒 t I ，2 A U C 限T C L 缩略词表 液相色谱一串联质谱技术( 1 i q u i dc h r o m a t o g r a p h yc o u p l e dt ot a n d e m m a s ss p e c t r
2、o m e t r y ，) 高效液相色谱( 1 l i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ) 蛋白沉淀( p r o t e i np r e c i p i t a t i o n ) 液液萃取( 1 i q u i d - l i q u i de x t r a c t i o n ) 固相萃取( s o l i d p h a s ee x t r a c t i o n ) 选择反应监测( s e l e c t e dr e a c t i o nm o n i t o r i n g )
3、 多反应监测( m u l t i r e a c t i o nm o n i t o r i n g ) 质控( q u a l i t yc o n t r 0 1 ) 达峰浓度( m e a s u r e dm a x i m a lc o n c e n t r a t i o n ) 达峰时间( t i m et a k e nt oa c h i e v ep e a l 【c o n c e n t r a t i o n ) 消除半衰期( t r e m i n a le l i m i n a t i o nh a l f - l i f e ) 药时曲线下面积( a e
4、 r au n d e rc o n c e n t r a t i o n - t i m ec u r v e ) 平均滞留时间( m e a nr e s i d u et i m e ) 清除率( c l e a r a n c e ) 9 - 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责 任。 学位论文作者签名0 ，、 刈农 日期：妒扩年r 月圹日 学位论文版权使用授权声
5、明 本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定，第二 军医大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文( 保密的学位论文在解密后适用本授权 书) 学位论文作者签名： 导师签名：奶甲 日期：加r 年f 月珥日 日期：讨年f 月讨日 生物样品高通量液相色谱分析方法学研究及其药代动力学应用 摘要 药物代谢动力学旨在通过测定生物样本中的药物或者代谢产物的浓度，定量 描述药物进入体内以后的吸收、分布、代谢、排泄过程，进而阐明药
6、物的药效或 者毒性，为新药研究的代谢筛选和临床用药的疗效评价提供重要依据。面对不断 涌现的大量候选药物，在进行药效学研究的同时，需要进行药代动力学评价，这 就要求建立并优化相关分析方法对生物样品中的目标成分( 药物、代谢产物、其 他外源性成分) 进行高灵敏度、快速准确的定量分析。基于反相整体柱的快速分 析测定方法、9 6 孔板形式的高通量前处理技术和液相色谱串联质谱( L C - l S M S ) 的高灵敏快速测定方法，本文构建了“准确、灵敏、高通量”的分析策略，并将其 应用到新药药代动力学研究中。 一、生物样品高通量分析在药代动力学中的应用进展 临床前药代动力学研究包括动物实验、方法学考察
7、和验证、样品前处理、样 品分析、数据处理5 个方面，其中大部分和分析方法的建立与应用紧密相连。现 代分析科学在药代动力学研究中体现出举足轻重的地位，只有建立可靠、专一、 灵敏、快速的生物样品分析方法，才能够实现高通量生物样品分析过程，满足药 代动力学研究大样本量的要求。本文对高效液相色谱中整体柱的应用以及基于 L C M S M S 快速分析方法的建立进行了综述。详细介绍了整体柱自身特点以及和 传统填料色谱柱的区别，并且对其在药物分析及生物样品测定中的应用进行了回 顾，选择高流动相流速即可以实现整体柱上的高通量分析。对于在生物样品高通 量分析中占主导作用的L C M S M S 技术，本文对其
8、样品前处理、基质效应、离子 串扰以及样品残留等问题进行了讨论，根据以往研究结果认为采用合适的9 6 孔样 品前处理技术不仅可以提高样品前处理过程中的通量，而且有助于改善影响目标 成分检测时可能出现的基质效应、样品残留等问题，从而获得准确、灵敏、高通 量的生物样品分析方法。 二、反相整体柱液相色谱在药代动力学中的应用研究 本文建立了人血浆中普卢利沙星代谢产物N M 3 9 4 和S D 大鼠及B e a g l e 犬血浆 中艾迪康唑的反相C 1 8 填充柱和反相C 1 8 整体柱的快速分析测定方法，考察了常 规色谱柱的分析方法转移到整体柱上的适用性，研究整体柱在进行生物样品分析 时流动相组成、
9、缓冲液p H 值、柱温以及流速对目标成分保留性质的影响，并且 第二军医大学博士学位论文 对常规色谱柱和整体柱的分析时间及测定结果进行了比较。结果显示，目标成分 在整体柱上的色谱行为和在常规色谱柱上相似，方法移植后通过对流动相组成及 p H 值的微调即可在整体柱上使用。在此基础上建立了B e a g l e 犬血浆中高血压药 物氨氯地平和厄贝沙坦同时测定的分析方法，利用整体柱多孔填料的低柱压优势， 采用高流速进行色谱分析以缩短测定时间，常规条件下即可实现生物样品的高通 量分析。 1 、针对人血浆中的N M 3 9 4 ，采用C h r o m o l i t h 反相C 1 8 整体柱( 4 6
10、 x 1 0 0 m m ) 进 行色谱分析，流动相组成为乙腈水( 磷酸调p H3 0 ) ( 1 5 ：8 5 ，v v ) ，流速为2 m l m i n ， 荧光检测激发波长为2 8 0 r i m ，发射波长为4 2 5 n m ，柱温2 5 1 2 。2 0 0t t l 血浆样品用 1 0 高氯酸进行蛋白沉淀后进样分析，结果显示N M 3 9 4 和内标洛美沙星的保留时 间分别为3 1 和2 3m i l l ，生物样品内源性物质不干扰目标成分的测定，每个样品 分析周期为4r a i n 。与以往方法相比此法缩短了2r a i n ，提高了样品分析速度，测 定结果和常规方法相当。
11、2 、针对B e a g l e 犬血浆中的艾迪康唑，采用C h r o m o l i t h 反相C 1 8 整体柱( 4 6 x 1 0 0 m m ) 进行色谱分析，流动相组成为乙腈2 0 m m o l LN a H 2 P 0 4 ( 磷酸调p H 3 8 ) ( 3 5 ：6 5 ， v v ) ，流速为2 m l m i n ，紫外检测波长为2 3 0 r i m ，柱温2 5 。血浆样品用氢氧化 钠碱化后经正己烷液液萃取，艾迪康唑和内标0 5 2 2 的保留时间分别为2 7 和3 2 r a i n ，生物样品内源性物质不干扰目标成分测定，每个样品的分析周期为4m i l l
12、 。 与以往方法相比此法不仅缩短了分析时间6r a i n ，而且提高了检测灵敏度，最低定 量限达到1 0 n g m l 。 3 、针对治疗高血压的复方氨氯地平厄贝沙坦制剂临床前药代动力学研究的要求， 采用C h r o m o l i t h 反相C 1 8 整体柱( 4 6 x 1 0 0 m m ) 在6 5r a i n 内对B e a g l e 犬血浆中 的氨氯地平和厄贝沙坦进行分析，流动相组成为乙腈甲醇2 0 m m o l L N a H 2 P 0 4 ( 磷 酸调p H 3 O ) ( 2 5 ：2 0 ：5 5 ，v v v ) ，流速为2m l m i n ，紫外检测
13、波长为2 3 8 n m ，柱温 2 5 。血浆样品采用O a s i sM C X 固相萃取小柱进行净化和富集，选择同类高血压 药物维拉帕米和替米沙坦分别作为氨氯地平和厄贝沙坦定量分析的内标，氨氯地 平、维拉帕米、厄贝沙坦和替米沙坦的保留时间分别为3 0 、2 4 、4 4 和5 4r a i n ， 血浆内源性物质不干扰目标成分测定，可以满足复方氨氯地平厄贝沙坦制剂的临 床前药代动力学研究的需要，并且为高血压药物联合治疗后的血药浓度监测提供 了值得借鉴的高通量分析方法。 2 - 生物样品高通量液相色谱分析方法学研究及其药代动力学应用 三、9 6 孔板样品前处理技术在体内药物分析中的应用研究
14、 在L C M S M S 的应用过程中，本文重点对整个生物样品分析过程中的限速环 节样品前处理进行了方法学的改进和优化，采用9 6 孔板形式对生物样品进行 纯化，提高了单位时间内样品通量，实现了大规模样品前处理和液质快速测定的 高通量分析。除了常规方法学验证之外，还对基质效应、离子串扰、样品残留等 问题进行了探讨，通过选择合适的色谱柱和流动相条件，改进前处理方法等手段， 降低或者消除生物样品分析过程中基质效应带来的离子抑制或增强、离子串扰引 起的通道干扰和样品残留导致的线性偏移等问题，保证生物样品高灵敏度、高准 确度的快速分析。 1 、实验采用9 6 孔板对人血浆中的福多司坦进行蛋白沉淀，考
15、察了不同色谱柱上 基质效应的影响。所选择的内标化合物厄多司坦由于其与目标成分结构类似，很 好的跟踪目标成分在离子源内的变化，保证二者的信号比值不变，增加了定量准 确度。与现有方法相比，该方法在样品前处理、检测灵敏度和分析通量上均具有 明显优势。简化了样品前处理步骤，提高了样品前处理通量，缩短了色谱分析时 间，仅使用5 0p l 血浆，灵敏度达到了0 0 2I , g n a ，并成功地应用于福多司坦的临 床药代动力学研究中。 2 、实验采用9 6 孔板对B e a g l e 犬血浆中的克伦特罗进行液液萃取，考察叔丁基甲 醚、正己烷以及二者的等比混合提取溶剂对血浆样品提取回收率和基质效应的影
16、响。比较了血浆样品纯化后的富集程度对提取回收率和基质效应的影响，结果显 示血浆样品提取物稀释l 倍后提取回收率没有明显变化，但是离子抑制情况得到 了一定的改善。通过在流动相中添加O O l 甲酸，并结合提取过程中的样品稀释， 最大程度地减小样品在进样过程中的残留，保证了0 1 , - - 1 0 r i g h a 范围内血浆标准 曲线线性良好。该法同样成功地应用于盐酸克伦特罗双层片和普通片的临床前药 代动力学和生物等效性研究中。 3 、实验采用S i r o c o o 蛋白沉淀板对S D 大鼠血浆中的抗肿瘤创新药物候选化合物 海洋环肽类化合物P h a k e l l i s t a t i n1 3 ( P K l 3 ) 进行快速蛋白沉淀，沉淀后过滤得到 的滤液直接进样L C M S M S 分析。通过比较传统蛋白沉淀方法和沉淀后过滤方法 对血浆样品提取回收率和基质效应的影响，发现采用沉淀后过滤的方法可以显著 的降低P K l
