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1、 分类号 密级 国际十进分类号（UDC） 第四军医大学 学位论文 抑制蛋白酶体干扰骨髓瘤细胞抑制蛋白酶体干扰骨髓瘤细胞 未折迭蛋白反应与自噬未折迭蛋白反应与自噬 （题名和副题名） 高 瑛 （作者姓名） 指导教师姓名 陈协群 教授（主任医师） 指导教师单位 第四军医大学西京医院血液科 申请学位级别 博士 专业名称 内科学（血液病） 论文提交日期 2009.04 答辩日期 2009.05 论文起止时间 2007 年 3 月 至 2009 年 3 月 学位授予单位 第四军医大学 独独独独 创创创创 性性性性 声声声声 明明明明 秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我 个人在导师
2、指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文 中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过 的研究成果，不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示了致谢。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名： 日期： 保保保保 护护护护 知知知知 识识识识 产产产产 权权权权 声声声声 明明明明 本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在 校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第四军医大学。本人保证毕业 离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单
3、位仍然为第四军医大学。 学校可以公布论文的全部或部分内容（含电子版，保密内容除外） ，可以采 用影印，缩印或其他复制手段保存论文。学校有权允许论文被查阅和借阅， 并在校园网上提供论文内容的浏览和下载服务。 论文作者签名： 导师签名： 日期： 抑制蛋白酶体干扰骨髓瘤细胞抑制蛋白酶体干扰骨髓瘤细胞 未折迭蛋白反应与自噬未折迭蛋白反应与自噬 研 究 生：高 瑛 学科专业：内科学（血液病） 所在单位：第四军医大学西京医院血液内科 导 师：陈协群 教授（主任医师） 资助基金项目：国家自然科学基金 NO.30871089 关键词：蛋白酶体抑制剂，骨髓瘤细胞，未折迭蛋白反应，凋亡，自噬 中国人民解放军第四军
4、医大学 2009 年 05 第四军医大学博士学位论文 1 目目 录录 缩略语表 . 2 前 言 . 13 文献回顾 . 15 1. 试验材料 . 44 2. 试验方法 . 46 3 结 果 . 51 3.1 骨髓瘤细胞未折迭蛋白反应与自噬过程相互依赖 . 51 3.2 硼替佐米干扰骨髓瘤细胞未折迭蛋白反应并诱导其凋亡 . 57 3.3 硼替佐米干扰骨髓瘤细胞自噬反应 . 64 4. 讨 论 . 73 小 结 . 76 参考文献 . 77 个人简历和研究成果 . 91 致 谢 . 93 第四军医大学博士学位论文 2 缩略语表缩略语表 缩略词缩略词 英文全称英文全称 中文全称中文全称 MM Mul
5、tiple myeloma 多发性骨髓瘤 PI Proteasome inhibitor 蛋白酶体抑制剂 UPP Ubiquitin- proteasome pathway 泛素- 蛋白酶体通 ER Endoplasmic reticulum 内质网 ERS Endoplasmic reticulum stress 内质网应激 UPR Unfolded protein response 未折迭蛋白反应 ERAD ER- associated protein degration 内质网相关性蛋白 GRP78/BiP glucose- regulated protein78 / Immuno- g
6、lobulin binding protein 78kD 葡萄糖调节 蛋白/免疫球蛋白 重链结合蛋白 EDEM ER degradation- enhancing mannosidase- like protein - 甘露糖苷酶样应 激蛋白 IRE1 type I transmembrane protein kinase/ endoribonuclease I 型跨膜蛋白激酶/ 核糖核酸内切酶 GADD153/CH OP growth arrest and DNA damage- inducible gene 153/ CCAAT/enhancer binding protein (C/EB
7、P) homologous protein 生长抑制、 DNA 损 伤 诱 导 基 因 / CCAAT 增强子结 合蛋白同源蛋白 eIF2 eukaryotic translation initiation Factor 2 真核细胞翻译起始 因子 2 第四军医大学博士学位论文 3 XBP- 1 X box binding protein 1 X 盒结合蛋白 PERK R- like endoplasmic reticulum kinase 蛋白激酶 R类似的 TRAF2 TNF- receptor associated factor 2 TNF受体相关因子 ATF6 Activating t
8、ranscription factor 6 活化转录因子 6 JNK cJun Nterminal kinase c- Jun 氨基酸末端 RNAi RNA interference RNA 干涉 DRiPs Defecitive ribosomal products 缺陷型核糖体产物 PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电 Bor Bortezomib 硼替佐米 BFA Brefeldin A 蓝菌素 A Tg Thapsigargin 毒胡萝卜素 VCR Vincristine 长春新碱 VP- 16 Etoposide 足叶乙甙
9、MITO Mitoxantrone 米托蒽醌 HCQ Hydroxychloroquine 羟基氯喹 Rapa Rapamycin 雷帕霉素 3- MA 3- methyladenine 3- 甲基腺嘌呤 第四军医大学博士学位论文 4 抑制蛋白酶体干扰骨髓瘤细胞抑制蛋白酶体干扰骨髓瘤细胞 未折迭蛋白反应与自噬未折迭蛋白反应与自噬 博士研究生： 高 瑛 导 师： 陈协群 教授 第四军医大学西京医院血液内科，西安 710032 中中 文文 摘摘 要要 背景和目的：背景和目的：多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)作为一种浆 细胞恶性肿瘤，其高蛋白合成与分泌活性极易导致未/错折迭蛋白
10、积 聚于内质网腔，故骨髓瘤细胞极易诱发内质网应激（endoplasmic reticulum stress， ERS） 。 ERS 的生化基础称为未折迭蛋白反应 （unfolded protein response，URP） 。UPR 作为一种旨在修复、稳定内质网功能的 细胞适应性反应，能通过 IRE1 与 PERK/eIF 信号通路而调控分子 伴侣 BiP 表达及转录因子 XBP- 1、CHOP 的活化，其中 BiP 与 XBP- 1 促进细胞生存，而 CHOP 则介导细胞凋亡。两类信号间的紊乱失衡最 终导致细胞死亡。真核细胞适应性反应除了 UPR，还有自噬反应 （autophagy） 。自
11、噬是真核细胞适应营养或生长因子缺乏、低氧、内 质网应激等有害刺激， 由溶酶体介导的长寿命蛋白或细胞器的降解的 一种分解性代谢反应。自噬体形成是自噬的关键步骤， 而自噬体形 成依赖 Atg5 及 Atg8/LC3 等自噬相关蛋白与 Beclin1- 磷脂酰肌醇三磷 酸激酶(PI3K)复合物的综合调控。 研究表明， 在酵母细胞中 UPR 既能 第四军医大学博士学位论文 5 触发凋亡又能诱发自噬， 而在骨髓瘤细胞中， UPR 与自噬关系尚不清 楚。 蛋白酶体抑制剂硼替佐米（Bortezomib）能选择性抑制 26S 蛋白 酶体，对多发性骨髓瘤临床疗效显著，其抗瘤效应可能通过干扰 NF- B 信号来实
12、现，然而最近发现 NF- B 抑制剂诱发骨髓瘤细胞凋 亡的程度却远不及蛋白酶体抑制剂显著。提示 NF- B 途径不能完全 解释硼替佐米的抗瘤效应。 近年报道内质网应激诱导的细胞凋亡为硼 替佐米的重要效应机制，但其具体调控过程尚不清楚。考虑到内质网 应激与 UPR 及自噬调控之间的相互关系，以及 UPR 与自噬在骨髓瘤 细胞死亡调控中的作用，我们设想，硼替佐米极可能通过影响 UPR 与自噬的调控过程而发挥其抗骨髓瘤效应。 方法和结果方法和结果：为了探讨骨髓瘤细胞 UPR 与自噬之间的关系，我们 绘制了经内质网应激剂和/或自噬诱导剂处理骨髓瘤细胞 H929 和 RPMI8226 的剂量- 效应曲线
13、，确定了所用药物的实验浓度，并采用 Western blot 检测靶细胞 UPR 和自噬相关蛋白的表达。结果表明：(1) 采用自噬诱导剂雷帕霉素分别处理H929 和RPMI8226细胞不同时间 后，靶细胞中 UPR 相关蛋白 XBP- 1s、XBP- 1u、BiP、CHOP 和自噬 相关蛋白 LC- 3、Beclin- 1、Atg- 5、PI3KC3 的表达均呈时间依赖性的 增加；(2)经标准内质网应激剂 BFA 或 Tg 处理不同时间后，H929 和 RPMI8226细胞凋亡率及上述UPR相关蛋白和自噬相关蛋白的表达均 呈时间依赖性的增加； (3) 雷帕霉素能干扰 BFA 或 Tg 诱导的 UPR 相 关蛋白的表达； (4) BFA 或 Tg 可以干扰雷帕霉素诱发的自噬相关蛋白 的表达。以上结果强烈提示，在骨髓瘤细胞中，UPR 与自噬反应的调 控过程相互依赖。 第四军医大学博士学位论文 6 为了进一步探讨硼替佐米是否造成 UPR 信号紊乱失衡，我们以 不同方式处理细胞后， 我们采用 Annexin - FITC/PI 双染联合流式细 胞术检测靶细胞凋亡率； 采用 Western blot 检测靶细胞 UPR 相关蛋白 的表达。结果表明：(1)经硼替佐米、BFA 和 Tg 处理不同时间后，靶 细胞凋亡率及 UPR 相关蛋白的表达均
