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1、山东大学 硕士学位论文 瑞氏木霉N-糖基化途径的人源化改造初探 姓名：张莹宽 申请学位级别：硕士 专业：微生物学 指导教师：汪天虹 20080429 夸忑P b p c b h C H O C M P E P O E R G a l G a l T G l c 山东人学硕I j 学位论文 缩略词表 a d e n o s i n et r i p h o s p h a r e 腺苷三磷酸 b a s ep a i r ( s ) 碱基对 c e l l o b i o h y d r o l a s e纤维二糖水解酶 C h i n e s eh a m s t e ro v a r y c
2、 y t i d i n em o n o p h o s p a t e e r y t h r o p o i e t i n e n d o p l a s m i cr e t i c u l u m g a l a c t o s e p 一1 ，4 - g a l a c t o s y l t r a n s f e r a s e g l u c o s e G l c N A c N - a c e t y l g l u c o s a m i n e G M P G n T I g p d A h p h H P L C k b L B L C M S M a n M n
3、 T s M S N M R g u a n i n em o n o p h o s p h a t e 中国仓鼠卵巢细胞 胞：舒一磷酸 红细胞生成素 内质网 半乳糖 D 一1 ，4 一半乳糖基转移酶 葡萄糖 N 乙酰葡糖胺 鸟苷一磷酸 N - a c e t y l g l u c o s a m i n y lt r a n s f e r a s eIN 乙酰氨基葡萄糖转移酶I g l y c e r a l d e h y d e s - 3 - p h o s p h a t e 甘油醛3 磷酸脱氢酶A 基因 d e h y d r o g e n a s eAg e n e h
4、y g r o m y c i nBp h o s p h o t r a n s f e r a s e潮霉素B 磷酸转移酶 h i g h p e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y k i l o b a s e ( s ) L u r i a B e r t a n i ( m e d i u m ) 高效液相色谱 千碱基 ( 细菌用培养基) l i q u i dc h r o m a t o g r a p h yc o u p l e dt o液相色谱质谱联用 m a s ss p e c t r o
5、m e t r y m a n n 0 S e m a n n o s y l t r a n s f e r a s e m a s ss p e c t r o m e t r y 甘露糖 甘露糖基转移酶 质谱 n u c l e a r m a g n e t i c r e s o n a n c e核磁共振 s p e c t r o s c o p y 7 山东人学硕I j 学位论文 P A G E P C R P E G P y r e S D S S T 6 G a l I t r p C U D P 8 P o l y a c r y l a m i d eG e lE l
6、e c t r o p h o r e s i s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 P o l y m e r a s eC h a i nR e a c t i o n 聚合酶链式反应 p o l y e t h y l e n eg l y c o l 聚乙烯K , - - - 醇 o r o t i d i n e 5 m o n o p h o s p h a t e 乳清酸核苷- 5 一磷酸脱羧酶 d e c a r b o x y l a s e S o d i u mD o d e c y lS u l f a t e s i a l y l t r a n s f e r a s e 十二
7、烷基磺酸纳 0 【2 ，6 唾液酸转移酶 i n d o l e 3 g l y c e r o lp h o s p h a t es y n t h a s e 吲哚甘油磷酸合成酶基因 g e n e ( t r y p t o p h a no p e r o n ) ( 色氨酸合成操纵子) u r i d i n ed i p h o s p h a t e尿苷二磷酸 山东人学颂I ：学位论文 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。 对本文的研
8、究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：越虚1日期：2 盟星：圭 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东人学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部 门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东人学可以将本 学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采川影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：塑瞳豇导师签名： 山东人学硕I j 学位论义 摘要 药用糖蛋白是生物工程产品中最重要的一类。随着基因工程技术和现
9、代医学 的不断发展，药用人源或动物来源的重组蛋白质的生产对各种宿主表达系统提出 了更多的糖基化修饰的要求，以确保药物产品的安全性、药效和均一性。研究人 员已丌始对各种基因工程宿主表达系统，包括细菌、酵母、丝状真菌、昆虫细胞、 C H O 细胞及转基因植物等表达系统进行糖基化修饰途径的改造，以期望得到能够 产生与人或哺乳动物糖基化形式相近的工程菌株，从而应用于入源糖蛋白的生产， 提高药用糖蛋白的活性和稳定性。 在目自 常用的真核来源药用蛋白表达系统中，由于原核生物表达系统缺少必 要的蛋白质糖基化修饰，而哺乳动物细胞表达系统虽然能够生产人源化糖蛋白， 但由于重组蛋白产量低、培养时间长及成本昂贵等原
10、因，其应用规模与范围受到 较大的限制。酵母和丝状真菌是最常用的工业发酵用真核微生物，具有易操作、 发酵周期短及成本低廉等优点。与酵母相比，丝状真菌糖蛋白N 聚糖糖基化的程 度低，其寡聚糖加工系统和N 糖基化类型更接近于人的加工系统和人源糖蛋白的 寡聚糖类型。因此，丝状真菌作为一种新的极有希望的真核表达系统已引起广泛 关注。 丝状真菌瑞氏木霉( T r i c h o d e r m ar e e s e i ) 具有极强的蛋白分泌能力和真核生 物的翻泽后修饰、加工过程，是非常有应用前景的真核表达系统。但瑞氏木霉与 哺乳动物问的糖基化修饰形式仍存在一定的差异。哺乳动物N 聚糖的经典加工途 径产生
11、复合型N 聚糖，而瑞氏木霉的N 聚糖一般为寡甘露糖型，使利用瑞氏木霉 为宿主生产的人源重组糖蛋白临床理化性质和药理作用受到一定的影响。因此， 有必要丌展瑞氏木霉N 聚糖工程，使瑞氏木霉所产糖蛋白N 聚糖类型与哺乳动物 典型的复合型N 聚糖尽可能接近。 瑞氏木霉N 聚糖加工途径的早期阶段与哺乳动物相同，产生G I e 3 M a n 9 G I e N A e 2 聚糖d 仃体结构。此后，由于缺乏必要的甘露糖苷酶而不能完成甘露糖残基的修剪， 又缺乏必要的糖基转移酶而不能完成多种单糖组分在特异前体的添加，最终只能 形成寡甘露糖型N 聚糖。而哺乳动物复合型N 聚糖是在多种甘露糖：舒酶和N 乙酰 氨基
12、葡萄糖转移酶、半乳糖基转移酶、唾液酸转移酶等糖基转移酶的共同作用下 形成。 J 1 东人学硕I j 学位论文 本研究欲改造瑞氏木霉N 聚糖途径，首先敲除瑞氏木霉固有的甘露糖基转移 酶基因，以去除冗余的末端甘露糖残基，产生蛋白糖链的核心五糖结构。然后转 入并表达外源N 乙酰氨基葡萄糖转移酶、半乳糖基转移酶和唾液酸转移酶，从而 向核心五糖上依次添加N 乙酰氨基葡萄糖、半乳糖和唾液酸，产生术端唾液酸化 结构的复合型N 一聚糖，最终实现瑞氏木霉N 糖基化修饰途径的人源化系统改造， 为人源糖蛋白的生产做前期准备。 为了敲除瑞氏木霉自身的a 1 ，3 甘露糖基转移酶基因 ( 0 【1 ，3 m a n n
13、 o s y l t r a n s f e r a s eg e n e ，a 1 9 3 ) ，同时在瑞氏木霉中表达外源旺- 2 ，6 - 唾液酸 转移酶基因( Q 2 ，6 s i a l y l t r a n s f e r a s eg e n e ，S T 6 G a l I ) ，本文构建了含同源敲除表达盒 P a l 9 3 - S T 6 - T a l 9 3 酐J 载体p S A M 。用质粒p S M 与含有来自爿n i g e rI 佝p y r G 基因的 丝状真菌表达质粒p A B 4 1 共转化瑞氏木霉r G 营养缺陷型菌株M 2 3 ，p y r G 基因的
14、 转入和成功表达可以使M 2 3 恢复野生型性状。用P C R 进行初筛从约三千株转化子 中获得5 株可能的同源整合转化子，但其中4 株转化子不能正常产生孢子和传代培 养。对这4 株原始转化子染色体D N A 样品进j T P C R 和荧光定量P C R 分析，显示该 D N A 样品为目标突变株和出发菌株M 2 3 染色体D N A 的混合体系，即存在出发菌株 M 2 3 染色体D N A 的干扰。其中M 2 3 染色体D N A 含量分别占样品总量的8 2 、6 9 、 7 7 和7 9 ，表明这4 株突变株中口郴基因确实被敲除，并推测由于口郴基因通过同 源双交换被敲除使突变株不能存活，
15、显示口郴基因编码产物是瑞氏木霉生存所必 需的。另外一株转化子Zr e e s e ib 8 1 能够存活并多次传代，P C R 分析结果显示b 8 1 0 0 P a l 9 3 - S T 6 - T a l 9 3 而 N 敲除表达盒是插入在劬筘基因序列下游约1 8 0 0b p 处的终 止子编码区，而a 1 9 3 基囚编码区未被破坏；R T - P C R 结果表明a 1 9 3 和S T 6 G a l I 基因均 有表达活性，但a t 9 3 基因的表达活性降低；荧光定量R T - P C R 结果显示b 8 1 的口栖 基因表达量为出发菌株M 2 3 的8 0 。分析原因认为表达
16、盒P a l 9 3 - S T 6 - T a l 9 3 的同源 整合和外源S T 6 G a l I 基因的表达在一定程度上影响T a l 9 3 基因的表达活性。 为了在Zr e e s e i r 扣表达外源p 1 ，4 - 半乳糖基转移酶( 1 3 - 1 ，4 - g a l a c t o s y l t r a n s f e r a s e ， G A I T ) 基因和N 乙酰氨基葡萄糖转移酶( N a c e t y l g l u c o s a m i n y lt r a n s f e r a s eI ，G n T I ) 基因，构建了含P c b h l G n T I - T c b h l 和P p g d A G a l T - T t r p C 双表达盒的真核表达载体 p G G 。用质粒p G G 与携带有Ec o l i 潮霉素抗性基因的丝状真菌表达质粒p A N 7 1 共 转化Zr e e
