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1、第十二届全国动物繁殖学术讨论- g 论文集 猪胚胎冷冻保存试验研究初报 刘丑生1 王志刚“邓凯伟2 1 孔学民赵俊金1 朱芳贤，曾维斌3 全国畜牧兽医总站畜禽牧草种质资源保存利用中心l 南京农业大学动物科技学院2 甘肃农业大学动物科技学院3 摘要本研究采用通过胚胎在冷冻前在细胞松弛素B 处理研究表明，改进了玻璃化冷冻保存的胚胎 的培养效果，探讨1 损伤的胚胎细胞的细胞超微结构( 线粒体、细胞骨架) 的损伤机制。深入研究1 玻 璃化冷冻的胚胎损伤与线粒体的关系。 1 前言 猪早期发育阶段的胚胎其细胞质中含有大 量的脂肪滴颗粒，对低温极为敏感的特点，因此 早期胚胎在1 5 下时，容易受到低温损伤(
2、 P o l 。 l a r da n do t h e r s 1 9 9 3 ) 。猪胚胎在冷冻保存中受 到冷损伤可能与胚胎中的脂肪滴颗粒在冷冻的 过程中，其结构被破坏或发生变化，形成了大的 脂肪滴颗粒，使胚胎受到一定的损伤。胚胎随着 发育的进行，胚胎细胞质中的脂肪滴颗粒逐渐减 少，发育到孵化囊胚时脂肪滴的含量下降到最 低，胚胎在这一阶段适合冷冻( N a g a s h i m ae t ，a l 1 9 9 2 ) 。 用传统的低温冷冻方法保存猪胚胎已经取 得了一定的成果，但冷冻需要花费较长的时间和 昂贵的费用，以及在冷冻过程中的细胞外液植冰 的复杂程亭。用玻璃化冷冻猪晚期阶段的胚胎
3、也取得了一定的成功。把胚胎放入到一小滴冷 冻液滴中，胚胎吸入细管中马上投入液氮中，这 样可以快速的进行降温处理。 在胚胎冷冻的过程中，会造成胚胎的细胞的 超微结构造成一定的损伤。1 9 9 7 年G V A J T A 等对牛胚胎冷冻后进行细胞超微结构的检测时 发现胚胎的线粒体、细胞桥粒、细胞膜等结构在 冷冻中会受到一定的损伤。对胚胎在冷冻过程 中的超微结构的损伤对于进一步研究胚胎在冷 冻过程中的冷冻损伤的分子生物学机制具有重 要的意义。而在猪胚胎的冷冻过程中还没有进 行细胞超微结构损伤的研究。 本试验的目的是通过对猪胚胎的常规冷冻 和玻璃化冷冻，从而筛选出适合猪胚胎冷冻的冷 冻保护剂和适合的
4、胚胎冷冻程序。并且对胚胎 在冷冻后的胚胎活力和胚胎的线粒体损伤进行 研究。 2 材料和方法 2 I 试验动物试验猪为中国农业科学院畜牧 研究所种猪场青年母猪、成年母猪，1 5 胎。 2 2 实验用品与药品：体视镜、荧光显微镜 ( o I 脚U S 、日本) 离心机( S i g r m ) 日本株式会 王志刚为项目主持人。 率项目是国家十五科技攻关计划畜禽规模化养殖项目“猪的精液、胚胎冷冻技术研究”的部分内容。 一3 7 7 第十二届全国动物繁殖学术讨论会论文集 ! ! ! ! ! ! o ! o - - - - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ - - _ - _ _
5、_ _ _ _ - - - l _ _ - 一I - - _ _ _ - - - _ _ _ - _ - _ _ _ _ - - _ _ _ _ - - - _ _ - 一 社程序化冷冻仪E T 一1 N 、水浴锅，冷冻细管( 法 国卡苏公司) 、P M S G ( 内蒙古赤峰激素厂) 、H C G ( 宁波激素厂) 、P B S 、甘油( S i g m a ) 、乙二醇( 北京 化工厂) 、F C S ( 胎牛血清，H & YB i o ) 、B S A ( 牛 血清白蛋白华美公司) 、C B ( 细胞松弛素S i g r m ) 、p v P ( 聚已烯吡咯烷酮) 、蔗糖、T C M 一
6、1 9 9 、 冲E S ( 华美公司) 、二乙酰荧光素( S i g m a ) 、若 丹明1 2 3 ( S i g m a ) 2 3 超排处理及胚胎的采集 2 3 1 经产母猪在断奶后的第二天肌肉注射 P M S G1 2 0 0 单位( 可根据母猪体重酌情增减。以 每公斤1 5 1 8 单位为准) ，在注射P M S G7 2 小 时后肌肉注射H C G - 5 0 0 单位。 2 32 发情后进行配种。根据发情状况进行2 - - 3 次配种处理，并将配种的当天作为第0 天，配种 后的第六天手术法从子宫角冲卵。在冲卵操作 时用3 T C 的D P B S + 0 3 B S A 的冲
7、卵溶液进行 冲卵。冲出的胚胎放入到3 7 的D 】) B S + 1 0 F C S 的溶液中对胚胎进行质量的鉴定和分类。 选择不同发育阶段的胚胎分别进行冷冻保存。 3 胚胎的冷冻保存 3 1 胚胎常规冷冻 目前胚胎冷冻试验研究正在进行采用将第 6 天的回收的扩张囊胚和孵出囊胚，作以下处 理。在胚胎冷冻前胚胎先在T C M 一1 9 9 + 1 0 F C S + 7 5 u z r n l c B 在3 7 孵育3 0 分钟 A 组基础液：P B S + 2 0 F C S 冷冻l 液：P B S + 2 0 F C S + 0 7 5 M 的甘 油 冷冻2 液：P B S + 2 0 F
8、( + 1 5 M 的甘 油 B 组基础液：M 2 + 2 0 R ：S 冷冻1 液：M 2 + 2 0 F C S + 0 7 5 M 的甘 油十05 的B S A 冷冻2 液：M 2 + 2 0 F C S + 1 5 M 的甘油 + 0 5 的B S A 胚胎按常规法冷冻。 3 2 猪胚胎的玻璃化冷冻 A 组：孵化囊胚V S l ：6 5 M 甘油+ 6 B S A ( M 2 为基础液) 的冷冻液 胚胎先在T C M 一1 9 9 + 1 0 F C S + 7 5 u g m l C B 在3 7 孵育中培养4 0 分钟。 胚胎在2 5 V S l 冷冻液中平衡2 0 分钟后 将胚胎
9、在6 5 V S l 冷冻液中平衡2 0 秒，然后将 胚胎再放入到1 0 0 V S l 冷冻液中在3 0 秒的时 间内装入O P S 管投入到液氮中进行保存。 早期囊胚采用6 5 M 甘油+ 6 B S A ( M 2 为 基础液) 的冷冻液。 胚胎先在T C M 一1 9 9 + 1 0 F C S + 7 5 u g m l C B 在3 7 孵育中培养4 0 分钟。 胚胎在2 5 冷冻液中平衡3 分钟后将胚胎 放入含5 0 u l2 5 V S l 的1 5 m l 的离心管中，在 2 5 ( 2 下按1 3 0 0 0 转分钟的速度进行离心。离心 后胚胎在2 5 冷冻液中平衡3 分钟
10、，然后胚胎 在6 5 V S l 冷冻液中平衡2 0 秒。最后将胚胎 放入到l o o v S l 冷冻液中在3 0 秒的时间内装 入O P S 管投入到液氮中进行保存。 B 组：V S 2 ：8 h G + 7 P V P ( T C M 一1 9 9 为 基础液) 孵化胚胎在2 M E G ( T C M 一1 9 9 为基础液) 的冷冻液中先平衡5 分钟。然后将移入到V S 2 中在3 0 秒的时间内装入O P S 管投入到液氮中 进行保存。 早期胚胎在T C M 一1 9 9 + 1 0 0 , 6F C S + 7 5 u g m l C B 在3 7 孵育中培养3 0 分钟，然后将
11、 胚J j 自和5 0 u l 的T C M 一1 9 9 + 1 0 F C S + 7 5 u g m l C B 溶液放入到1 5 m l 的离心管中，在2 Y C 下 按1 3 0 0 0 转分钟的速度进行离心。离心后胚胎 在2 M E G ( T C M 一1 9 9 为基础液) 的冷冻液中先 平衡5 分钟，移入到V S 2 溶液中在3 0 秒的时间 第十二届全豳动物繁殖学术讨论会论文集 内装入O P S 管中投入液氮中进行保存。5 试验结果 3 4 胚胎线粒体损伤的检测活体胚胎荧光染料5 1 胚胎的常规冷冻 若丹明1 2 3 进行检测。 表1 胚胎的常规冷冻 从表1 可以看出在对猪
12、胚胎进行常规冷冻 保存时。B 组配方的冷冻保护剂对胚胎冷冻后 A 级胚胎存活率( 4 0 ) 高于A 组和对照组冷冻 保护剂冷冻胚胎后的A 级胚胎存活率( 3 0 、 1 1 1 1 ) 。表明基础液影响A 级胚胎存活率。 5 2 胚胎的玻璃化冷冻保存 表2 胚胎的玻璃化冷冻保存 在表2 中A 组的冷冻保存试验中发现孵化 囊胚在冷冻后的存活率( 6 0 ) 高于扩展囊胚的 存活率( 4 0 ) 。在B 组的冷冻保存试验中发现 孵化囊胚在冷冻后的存活率( 4 0 ) 高于扩展囊 胚的存活率( 3 0 ) 。这与F S B e e b ee ta 1 2 0 0 2 年发现的在对猪胚胎进行玻璃化冷
13、冻保存时孵 化囊胚比其他阶段胚胎能够获得高的体外存活 率的观点相同。从表2 中可以看出组A 组胚胎 的冷冻效果要明显优于B 组。 5 3 胚胎的培养试验 表3 胚胎的培养试验 一3 7 9 第 t - 二届全圈动物繁殖学a - g 讨论会论文集 从表3 中发现通过对不同冷冻方法冷冻保 存的猪胚胎解冻后进行胚胎试验现玻璃化冷冻 保存猪胚胎的冷冻效果( 5 0 ) 高于常规冷冻保 存( 2 0 ) 和对照组( 1 0 ) 的冷冻效果。 5 4 胚胎冷冻后的线粒体检测 表4 胚胎冷冻后的线粒体检测 不同发育阶断的胚胎的线粒体的形态和在 细胞内的分布分别为： ( 1 ) 桑椹胚其线粒体在细胞膜的周围呈
14、均 质的分布； ( 2 ) 密桑椹胚和囊胚其在透明带和细胞膜之 间的位置进行荧光染色时会发出高密度的荧光 反射。 ( 3 ) 扩展囊胚进行线粒体检查时在胚胎的卵 裂球上有一个为着色的区域，这个未着色的区域 即为细胞核。调整焦距看到囊胚腔可以看到囊 胚腔的中间呈现珍珠状的染色。 ( 4 ) 孵化囊胚可以看到透明带内的外层细胞 呈现为强度荧光。孵化囊胚在胚胎内部显示出 均等的线粒体分布的状况。 通过冷冻后的胚胎的线粒体的检测发现，玻 璃化冷冻猪胚胎的线粒体的完整率明显高于常 规冷冻的胚胎；胚胎的发育率与线粒体的完整性 有很大的关系( 见表3 。表4 ) 。 6 讨论 6 1 猪胚胎进行常规冷冻保存
15、时由于其降温速 度慢。在其降温的过程中不可避免的回在胚胎细 胞内形成冰晶，从而对胚胎造成了一定的机械性 损伤，造成了猪胚胎的常规冷冻时其冷冻效率较 低。 6 2 在猪胚胎的玻璃化冷冻猪胚胎的试验中，通 过对猪胚胎的冷冻研究发现猪胚胎冷冻时，其胚 胎的发育阶段对胚胎的冷冻后的形态有着重要 的影响。扩张囊胚和孵化囊胚由于其细胞质内 的脂肪滴颗粒较少。减少了在冷冻过程中的冷冻 损伤，有利于提高冷冻的成功率。 A 组胚胎的冷冻效果要明显优于B 组，其可 能的原因是高浓度的B S A 、h 乜溶液( 用h 乜溶液 作为基础液以取代传统的用P B S 作为基础液) 对胚胎在冷冻过程中提供了一定的保护作用。
16、 这与B e r t h e l o t ( 2 0 0 0 ) 发现的冷冻的基础液是影 响胚胎冷冻效果的一个重要因素的观点吻合。 6 3 常规冷冻保存和玻璃化冷冻保存的胚胎的 培养效果均有一定程度的提高。这可能与胚胎 在冷冻前在细胞松弛索B 的溶液中进行孵育从 而减少了胚胎细胞的细胞超微结构( 线粒体、细 胞骨架) 的损伤，引起胚胎培养存活率的提高。 这与本试验中线粒体的损伤的检测的结论相吻 合。 6 4 对胚胎进行胚胎活力的测定时，胚胎的活力 与胚胎的发育是相关的。胚胎活力的高低在一 定程度上代表了胚胎的发育率。对胚胎进行活 力测定时，其紫外线会对胚胎造成一定的损伤， 造成了胚胎活力于胚胎培养的发育率不相同，同 3 8 0 第十二届全圈动物繁殖学术讨南g - 会论文集 时胚胎在培养时的一些因素的影响也会回造成 结果的不
