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1、天津医科大学 博士学位论文 高抗凝、可诱导再生小口径人工血管的研究 姓名：魏屹晗 申请学位级别：博士 专业：生物医学工程 指导教师：顾汉卿 20100501 ， 天沣医科人学博十学位论文 中文摘要 目的血管疾病是世界上发病率最高的疾病之一，而血管移植术是其目前 主要的治疗手段。临床上应用的血管移植术材料主要来源为自体血管、异体血 管和人工材料。目前，大、中E l 径人工血管移植应用效果较好，而小口径移植 血管( 直径 2 h ，而 后以2 0 m g 基质对应1 0 m l 降解液将各基质置入1 0 0 U m lI 型胶原酶P B S 溶液中， 3 7 震荡反应，分别于1 h 、2 h 、4
2、 h 、8 h 、1 2 h 、2 4 h6 个时间点取出基质，蒸馏 水漂洗，冻干称重。各时问点降解率计算公式：降解率= ( W o W x ) W o x1 0 0 ， 其中W o 为初始质量2 0 m g ，W x 代表降解各时段基质干重。 ( 4 ) 变性温度测试 将材料分为2 组( n = 3 ) ：新鲜牛心包组，E D C 交联牛心包组。两组材料湿 态下剪碎，利用差示扫描量热法( d i f f e r e n t i a ls c a n n i n gc a l o r i m e t r y ，D S C ) 测定 各组材料的变性温度，这种方法广泛应用于测量胶原蛋白的热转变温度
3、 2 4 , 2 5 】， 用以评价交联处理对材料蛋白热稳定性的影响。本实验采用P e r k i n E l m e rD S C - 7 热变性分析仪，温度扫描范围4 0 “ C 1 0 0 “ C ，升温速率2 。C m i n ，记录材料出现 变性时的温度。 1 1 2 5 统计方法： 实验数据均以均值土标准差( x 土s ) 表示，将原始数掘输入计算机，采用 S P S S l 2 0 统计软件包进行数据统计分析，各组间差异的显著性采用丁检验，以 P O 0 5 ) ， 但是拉伸率下降了近一倍，弹性模量显著升高，说明交联处理增强了基质的韧 性，胶原纤维间形成交联，改善了牛心包的力学性
4、能。 表1 3 新鲜牛心包、脱细胞及交联处理牛心包力学性能比较( x s ，n = 5 ) 注：与新鲜牛心包比较差异有显著性，+ P O 0 5 ) ，但是拉伸率下降了近一倍，弹性模量显著升高，说明交联处理增强 O 囊薹_铲警艮 守m 疆 oe o台o 天津医科大学博士学位论文 一、牛心包膜预处理 了基质的韧性，胶原纤维问形成交联，改善了牛心包的力学性能。体外酶降解 实验中发现，经E D C 交联后的材料质量损失速率和程度远远慢于, b 于未经E D C 交联的材料。胶原酶是唯一可以在体内特异性水解胶原的蛋白酶，在胶原三螺 旋区的特殊位点上具有切割作用，比如作用在p r o Y - G l y
5、 p r o 链节的Y - G l y 处， Y 为中性氨基酸，如A l a 、L e u 。I 型胶原酶的a t l ( I ) 链的断裂位置在G l y - A l a ， 而0 【2 链发生断键的位置是G l y L e u 。胶原酶降解牛心包是一个渗透附着的过程。 在这个过程中，降解液向心包逐层渗透，胶原酶不同程度地沉积在纤维层之间、 纤维之间以及纤维上，并向周围扩散。当胶原酶接触到胶原蛋白肽链上的特定 位点时将肽链切断。牛心包经过交联处理，被切断的肽链可以通过交联键与其 它肽链相连而不进入降解液。另外，引入的交联键会导致酶结合位点的构象发 生改变，同时由于交联剂与各侧基的反应产生空间
6、位阻使酶分子的作用点被封 闭，因而经交联改性后的心包材料酶降解速度比较缓慢。变性温度测试结果显 示E D C 交联处理显著提高牛心包膜的热稳定性，由新鲜牛心包的6 2 8 提高到 8 6 1 ，两组差异有统计学意义( 尸 3 0 m i n ，按照 E D C ：N H S ：H e p 摩尔比= 7 5 ：1 2 5 ：1 ，将E D C 和N H S 溶于1 8 8 3 m l 含有2 ( W V ) H e p 的0 0 5 MM E S 缓冲液中作用1 0 m i n ，然后将预置好的基质放入此 溶液中，轻微震荡室温反应2 4 h 。然后基质在0 1 MN a 2 H P 0 4 中清
7、洗2 h ，4 MN a C I 中清洗2 4 h ( 每6 h 换一次液) ，蒸馏水清洗2 4 h ( 每6 h 换一次液) ，冷冻干燥 后密封室温保存待用。 注：为方便说明，将共价结合肝素组简称为E D C H e p 组 2 1 2 3 离子结合肝素1 4 7 】 阳离子剂选用聚乙烯亚胺( P E I ) 3 种不同分子量：1 8 0 0 D ，1 0 k D ，2 0 k D 。 已交联基质( 1 c m x l c m ) 浸入2 m l 含l m g m lP E I 的O 1 5 MN a C l 水溶液中作用 3 0 m i n ，P B S 冲洗3 遍，再放入2 m l 含0
8、 5 m m 1 肝素P B S 溶液中作用3 0 m i n ， P B S 冲洗3 遍：反复多次，层层叠加结合肝素。 注：根据P E l 分子量不同，离子结合肝素组分为：P E l l 8 0 0 一H e p 组，P E l l O k H e p 组， P E l 2 0 k H e p 组；各组义根据结合丹f 素层数不同( 1 0 层、1 5 层、2 0 层) 分为3 个弧组，以 。卜标1 0 ，1 5 ，x 2 0 表示。 2 1 2 4 共价离子联合结合肝素 将上述共价键合肝素法和离子结合肝素法联合使用，即对已交联基质先进 行共价键合肝素处理，而后在此基础上再进行离子结合肝素实验
9、。 注：基丁基质首先接受共价键合肝素，以及离子结合肝素中冈I 离子剂P E l 分子莓不同， 分组如卜：E D C P E l l 8 0 0 H e p 组，E D C P E l l o k H e p 组，E D C P E l 2 0 k H e p 组；各耋f l 义根据 离子结合肝素层数不同( 1 0 层、1 5 层、2 0 层) 分为3 个弧组，以卜I 标1 0 ，1 5 ，x 2 0 表示。 2 1 2 5 结合肝素量测定 肝素化基质经H N 0 3 溶解，通过电感耦合等离子体质谱仪( I C P M S ) 测定 S 含量进而计算得到结合肝素量( 肝素含硫量为9 1 2 9
10、) 。 I C P M S 是一种灵敏度非常高的元素分析仪器，通常是将供试品以水溶液的 气溶胶形式引入氩气流中，然后进入由射频能量激发的处于大气压下的氩等离 天津医科人学博十学侮论文 二、牛心包膜肝素化研究 子体中心区，等离子体的高温使样品去溶剂化、气化、原子化和电离，部分等 离子体经过不同的压力区进入真空系统，在真空系统内，使所形成的J 下离子在 电场作用下，按其质荷比m z 及其相对丰度显示在质谱图上。自然界中的每种 元素都存在一个或几个同位素，每个特定同位素离子给出的信号与该元素在样 品中的浓度呈线性关系，从而计算出该元素含量。 值得一提的是，对肝素含量测定方法，比较成熟和常用的分析手段
11、是甲苯胺 蓝分光光度法【4 8 1 ，即：甲苯胺蓝可以通过离子键吸附在肝素分子上，利用甲苯 胺蓝在6 3 l n m 处有最大吸收峰的特性，通过比较吸附前后甲苯胺蓝在6 3 1 n m 处 吸光度的差值，问接得到肝素含量。这种方法简单易行，价格低廉，得到了广 泛应用。但是这种方法不适用于本实验肝素量测定，原因在于甲苯胺蓝和肝素 之间是正负电荷吸引，与P E I 离子结合肝素相冲突，也就是浇P E I 与甲苯胺蓝 同性电荷排斥，甲苯胺蓝无法吸附到材料上，反应前后吸光度值无明湿差异。 2 1 2 6 肝素化基质红外光谱分析( F T I R ) 将肝素化基质剪碎研磨成粉末，冷冻干燥后，通过K B
12、r 压片法制成波片，用 傅罩叶红外光谱仪测定产物的红外光谱，分辨率为O 3 c m ，测试范围：I R 4 0 0 0 4 0 0C l n 一，扫描1 6 次。 2 1 2 7 肝素化基质含水能力测定1 4 叫 肝素化基质( 1 c m x l c m ) 冻干称重，浸入2 m l P B S ( P H 7 2 ) 溶液中，室温 孵育9 0 m i n ，倾去P B S ，将湿态基质放在倾斜6 0 0 的洁净玻璃板上2 m i n ，以滤纸 吸去渗出水分，称湿重。计算含水率= ( 湿重干重) 1 0 0 唰湿重。 2 1 2 8 肝素化基质表面亲疏水性能表征 采用J C 2 0 0 0 C
13、 1 接触角测量仪( 图2 1 ) ，考察无重力影响下，l m m 直径蒸 馏水与基质表面接触情况( 图2 2 ) ，从而表征基质表面的亲疏水性，每份样品 平行测定3 次。 天津医科人学博士学位论文二、牛心包膜肝素化研究 图2 1J C 2 0 0 0 C 1 接触角测量仪 图2 2 水滴接触牛心包膜瞬间 2 1 2 9 肝素化基质溶血试验 ( 1 ) 试样的分组配制 样品组：为了考察肝素结合方式、P E l 分子量、离子结合肝素层数等因素 影响，分组如下( n = 3 ) ：交联空白组、E D C H e p 组、P E l l 8 0 0 H e p ，1 5 组、 P E l l o k
14、 - H e p 、1 5 组、P E l 2 0 k - H e p 、1 0 组、P E l 2 0 k - H e p15 组、P E l 2 0 k - H e p 、2 0 组、 E D C P E l l 8 0 0 H e p1 5 组。每组样品湿重2 5 9 ，剪碎，加5 m l 生理盐水完全浸没。 阴性对照组：取3 支试管，每管加入生理盐水注射液5 m l 。 阳性对照组：取3 支试管，每管加入蒸馏水5 m l 。 ( 2 ) 制备新鲜的稀释抗凝兔血 从健康家兔耳缘静脉采血2 0 m l ，加入2 草酸钾溶液lm l ，即得新鲜的抗凝 兔血。再取新鲜抗凝兔血8 m l 加入生
15、理盐水注射液1 0 m l 稀释，即得新鲜的稀释 抗凝兔血。 ( 3 ) 溶血性检测 3 4 天津医科人学博十学位论文 二、牛心包膜肝素化研究 将上述试管放入3 7 + 1 恒温水浴锅中保温3 0 r a i n ，每支试管加入稀释兔血 0 1 m l ，轻轻振荡混匀后继续置于水浴锅中保温6 0 m i n 。吸出管内液体，离心 1 0 0 0 r p m ，1 0 m i n 。吸取上清液移入比色皿中，用7 2 2 分光光度计在5 4 5 n m 波长 处测定吸光度( o p t i c a ld e n s i t y ，O D ) 并记录结果。 ( 4 ) 数据处理 分别取样品组和对照组
16、3 个试样O D 的均值O D 。依下式计算样品的溶血率。 A B 溶血率= C B X l 0 0 式中：A 一样品0 1 ) ；B 一阴性对照组O D ；C 一阳性对照组O D 。 ( 5 ) 结果判定 若样品的溶血率 2 0 ，则应对该材料重复进行溶血试验。 2 1 2 1 0 统计方法 实验数据均以均值4 - 标准差( ；- e - s ) 表示，将原始数据输入计算机，采用 S P S S l 2 0 统计软件包进行数据统计分析，各组问差异的显著性采用丁检验，以 P 0 0 5 ) ，含水能力优 于离子结合方式各组；与新鲜牛心包相比，离子结合相关实验组中，P E l 分子量 越大，含水能力越差，P E l l O k 和P E l 2 0 k 的相关组别均与新鲜组差异有统计学意 义( P 0 0 5 ) ，优于单纯的 P E
