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1、上海交通大学 硕士学位论文 生长抑素受体在胆囊癌中的表达及意义 姓名：郭润生 申请学位级别：硕士 专业：外科学（普外） 指导教师：全志伟;杨勇 20080501 中文摘要 生长抑素受体在胆囊癌中的表达及意义 摘 要 目的目的 观察SST 及 SSTR 对胆囊癌组织细胞凋亡的影响；观察 SST 及 SSTR 对胆囊癌组织细胞周期的影响；初步探讨 SST 及 SSTR 在对胆囊癌细胞株周期阻滞的分子生物学机制。 方法方法 (1) 选取人胆囊癌细胞株 GBC-SD，常规体外培养，并裸鼠成 瘤。 （2）以 75ug/L 生长抑素加入 GBC-SD 细胞中，分别培养 12h、24h 及 36h 后，流式
2、检测细胞对照组及加药作用后的周期和凋亡的变化。(3) 免疫组化检测生长抑素受体亚型在胆囊癌细胞株及裸鼠成瘤组织中的表 达情况。 （4）免疫组化方法检测 22 例胆囊癌及 14 例非癌胆囊组织的生 长抑素受体的表达，分析受体的优势表达，及各受体在癌与非癌中的表 达差异性，并分析受体的表达与组织分化程度的关系。 （5）RT-PCR 方法 检测 SST 作用于胆囊癌细胞株 GBC-SD 后 SSTR3 核酸的表达变化。 结果结果 (1) GBC-SD 细胞在体外常规培养，生长旺盛；裸鼠接种 4 周 后可见明显荷瘤，病理切片镜下见腺癌组。 （2）流式检测免胆囊癌细胞 株的周期及凋亡的变化， 发现 GB
3、C-SD 细胞经 75ug/L 生长抑素分别作用 12h、24h 及 36h 后，在生长抑素作用 24h 时，细胞阻滞于 S 期的细胞最 多（P0.05） 。 （3）疫组化检测发现在 GBC-SD 细胞株及成瘤 组织中 SSTR 亚型蛋白的表达 SSTR3SSTR2，SSTR5SSTR1。 （4）免 疫组化检测癌与非癌组织中发现 SSTR1、2、3、5 四种亚型在胆囊癌组 织和正常胆囊粘膜均有表达，且 SSTR 表达的优势都是 SSTR3，胆囊癌 中 SSTR5 的表达明显高于正常胆囊粘膜（P 0.05). (3) Immunohistochemical method was used to
4、detect protein expression of SSTR subtypes in GBC-SD : SSTR3 SSTR2，SSTR5 SSTR1. (4)We found that SSTR1、SSTR2、SSTR3and SSTR5 could be detected both in gallbladder cancer and non-gallbladder cancer, the expression of SSTR3 is higher that any others substypes. SSTR5 in gallbladder cancer is significant
5、ly higher than in non-gallbladder cancer(P0.05). The expression of SSTR3 and SSTR5 reduced in poorly differentiated gallbladder cancer. (4) Semi-quantitive RT-PCR showed that, compared with the control group, the expression of SSTR3 mRNA increased significantly (P 0.05) treated by SST . 英 文 摘 要 6 CO
6、NCLUSION SSTR1、SSTR2、SSTR3and SSTR5 can be detected both in gallbladder cancer and non-gallbladder cancer. Result of cell cycle shows GBC-SD cells arrested in S-phase treated by SST, most significance in 24h. The molecular mechanism may be concerned with SSTR5. The expression of SSTR3 mRNA is up-reg
7、ulated of GBC-SD cells for treating with SST. The expression of SSTR3 and SSTR5 reduced in poorly differentiated gallbladder cancer, shows that SSTR3 and SSTR5 maybe relate to the progress of gallbladder cancer. KEYWORDS gallbladder cancer, somatostatin, somatostatin receptor, cell cycle, apoptosis
8、缩略词表 1 英中文缩略词表 ABBREVIATIONS 英文缩写英文缩写 英文全称英文全称 中文全称中文全称 SST Somatostatin 生长抑素 SSTR Somatostatin Receptor 生长抑素受体 SRS Somatostatin Receptor Scintigraphy 生长抑素受体显像 GH Growth Hormone 生长激素 PRL prolactin 泌乳素 GPCR G-Protein-Coupled Receptor G-蛋白偶联受体 PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链式反应 RT-PCR Reverse trans
9、cription PCR 逆转录 PCR EB Ethidium bromide 溴化乙锭 PI Propidium Iodide 碘化丙啶 FCM flow cytometry 流式细胞仪 rpm rotate per minute 每分钟转数 DMSO Dimethyl sulfoxide 二甲亚枫 FBS fetal bovine serum 胎牛血清 PBS phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液 上海交通大学上海交通大学 学位论文原创性声明学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明
10、引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究 做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意 识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 上海交通大学上海交通大学 学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许 论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存和汇编本学位论文。 保密保密，在 年解密后
11、适用本授权书。 本学位论文属于 不保密不保密。 （请在以上方框内打“” ） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 前 言 2 前前 言言 原发性胆囊癌在临床上虽少见（约占全身恶性肿瘤的 1%，消化道恶性肿瘤的 3%） ，但在胆道系统肿瘤中却最为常见（约占全部胆道系统恶性肿瘤的 64.7%） ，且 恶性程度高，术后 5 年存活率仅 515% 1。胆囊癌自 1777 年被发现以来，人们已经 历经两个多世纪的漫长探索，但对于这一疾病仍然缺乏早期诊断的方法，特别是对 于已经出现典型临床表现的进展期患者，尚无有效治疗方案 2。如何提高胆囊癌患者 的生存率和生活质量仍
12、是临床上迫切需要突破的难题。 作为治疗上相对有效的方法，手术完全切除病灶仍是胆囊癌最理想的治疗措施， 但其疗效依赖于确诊时间及可切除范围 3。 多数胆囊癌患者就诊时失去接受根治性手 术的机会，手术方式和手术切除率多年来没有明显的改进和提高。人们已经认识到， 胆囊癌患者生存期的延长需要求助于其他辅助治疗手段的进步。 人们根据胆囊癌易于局部浸润生长及其具有高复发率的生物学特性，曾认为术 中或术后放疗应对该疾病具有一定的效果。但文献报道的放疗在胆囊癌中的应用结 果令人失望，其报道也多见于化、放疗的联合运用 4。 对于胆囊癌的化疗，国内外尚缺乏统一的方案。一些联合给药的方式对于一些 进展期患者表现出一
13、定的近期有效率，这使得人们有理由相信化疗在胆囊癌的治疗 上有一定的应用潜力，但目前化疗的总体疗效评价并不令人满意 5。究其原因，胆囊 癌对化疗药物的敏感性极差，化疗药物的疗效并不能完全发挥，如何提高胆囊癌的 化疗敏感性，延长患者生存期一直是研究的热点。 化疗药物通过在肿瘤细胞周期各时相发挥细胞毒作用达到杀灭或抑制肿瘤细胞 的目的。在不断探索各种新型化疗药物和化疗方法的同时，人们设法以细胞周期调 控点事件作为靶点干预肿瘤细胞周期，使肿瘤细胞可以停滞在药物的靶周期，从而 增加靶细胞数量，改变肿瘤对化疗药物的敏感性 6。 细胞周期相关基因及产物组成复杂的分子网络。调控着细胞周期的演进，确保 细胞有序
14、地增生与凋亡。当调控细胞周期的分子网络成员发生异常改变时，细胞周 前 言 3 期失控， 导致细胞不协调地增生。 DNA受损等异常细胞不能凋亡， 肿瘤发生成为可能。 由此可见，细胞周期的失控和肿瘤的发生紧密关联。细胞凋亡在肿瘤发生发展过程 中主要起负调控作用，以阻遏肿瘤细胞迅速生长。故细胞周期的失控调节及凋亡的 失调，对肿瘤的发生起着重要的作用。 预初的实验研究发现 78，通过生长抑素（somatostatin，SST）干预胆囊癌细胞 周期，可以加强特定化疗药物的疗效。具体而言，通过SST在体外诱导胆囊癌细胞生 长，此时联合使用某些化疗药物（阿霉素）后，细胞凋亡增强，杀伤效果明显较单 用化疗药物
15、组提高。但这些实验结果是通过怎样的分子机制来实现的，我们尚不清 楚。要解释上述现象，必须设法明确SST是如何对胆囊癌细胞周期产生调控作用的， 又是如何在分子水平提高化疗药物的敏感性。 生长抑素是一种环状的多肽类激素，最初是从下丘脑分离出来的，因为能抑制 垂体释放生长激素而得名，广泛存在于人体的内分泌和外分泌系统中，具有广泛的 生物学效应。SST 存在两种分子形式，即 14 肽生长抑素(SS-14)和 28 肽生长抑素 (SS-28)，这两种形式不仅结构相似，其生物学活性也相似，主要表现为可抑制多种 内分泌、外分泌细胞的功能，调节胆道和胃肠道的运动，以及可作为神经递质调节 大脑的运动和识别功能。另外，SST 作为一种重要的细胞增殖和分化的激素调节肽， 可以抑制包括肿瘤细胞在内的各种细胞的增殖 910。 生长抑素及其类似物能对无论是 正常细胞或肿瘤细胞体外或体内都有明显的抑制增值的作用，这种作用是有不同的 机制的：通过直接和间接作用。间接作用是通过抑制促肿瘤生长的激素或细胞因子 的释放、抑制肿瘤血管生成、阻滞细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡来引起的。而接直 接作用是通过生长抑素受体来介导的。 SST 受体是一种具有 7 个跨膜区段的糖蛋白。自 1992 年 SSTR1 和 SSTR2 被克 隆成功至今, 已确认 SSTR 有 5 种不同的分子亚型, SSTR1
