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1、I025 利用盘基网柄菌表达可溶性人利用盘基网柄菌表达可溶性人 Fas 配体配体* 吴小霞 1 卢英华1,2,* 李清彪1,2 邓旭1 徐志南3 （1 厦门大学化学工程与生物工程系，福建 厦门 361005；2厦门大学福建省化学生物学重点实验室, 福建 厦门 361005；3 浙江大学化学工程与生物工程系生物工程研究所，浙江 杭州 310027） 摘摘 要要 报道了可溶性人 Fas 配体(shFasL)在盘基网柄菌中的克隆和表达。用 PCR 扩增从激活的 人中性粒细胞中得到的编码可溶性 Fas 配体胞外区中第 141 个到第 281 个氨基酸的 cDNA, 将其 与 hCG- 信号肽基因片段融
2、合到质粒 MB12neo 中，随后导入到盘基网柄菌 AX3 细胞中，得到分 泌性表达 hFasL 的两个重组工程菌 AX3-pCESFL95-G2 和 AX3-pCESFL95-H3。为提高 shFasL 的 表达量, 对质粒 pMB12neo 作了改造, 得到衍生质粒 pMB74, 利用质粒 pMB74 克隆表达 hFasL， 获得高通量表达 hFasL 的重组盘基网柄菌 AX3-pLu8。在复合培养基 HL-5C 中盘基网柄菌细胞密 度可达 1.5-2107 mL-1, 重组盘基网柄工程菌 AX3-pCESFL95-G2、AX3-pCESFL95 -H3 及 AX3-pLu8 分泌的 sh
3、FasL 浓度分别为 70 g L-1、23.5 g L-1及 206 g L-1。利用合成培养基 SIH 培 养盘基网柄菌细胞密度达到了 4-5107 mL-1, 重组盘基菌 AX3-pCESFL95-G2、 AX3-pCESFL95 -H3 及 AX3-pLu8 表达的 shFasL 浓度分别达到了 111 g L-1、106 g L-1和 420 g L-1。 关键词关键词 可溶性人 Fas 配体 盘基网柄菌 培养 EXPRESSION OF THE SOLUBLE HUMAN FAS LIGAND IN DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM* WU Xiaoxia1，LU
4、Yinghua1,2,* *，LI Qingbiao1,2，DENG Xu1 and XU Zhinan3 (1 Department of Chemical and Biochemical Engineering, Xiamen University, Xiamen 361005, Fujian, China; 2 Key Laboratory for Chemical Biology of Fujian Province, Xiamen University, Xiamen 361005,Fujian, China; 3 Institute of Biochemical Engineeri
5、ng, Department of Chemical and Biochemical Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, Zhejiang, China ) Abstract Dictyostelium discoideum was used to clone and express a soluble form of human Fas ligand. DNA encoding amino acids 141-281 of hFasL was PCR amplified from cDNA derived from activ
6、ated human neutrophils. The resulting product was fused with a DNA fragment encoding hCG- signal peptide and cloned in the expression vector pMB12neo. Dictyostelium *基金项目 基金项目：国家自然科学基金 (No. 20306025, 30370039) 资助项目。 *通讯作者。 Tel: 86-592-2183088; Fax: 86-592-2184822; E-mail: ylu. 第一作者：第一作者：吴小霞，女，24 岁，硕
7、士研究生。 1 2 strain AX3 was transfected with this plasmid, yielding two recombinant strains called AX3-pCESFL95-G2 and AX3-pCESFL95-H3. In order to improve the shFasL expression level, the expression vector pMB12neo was optimized by replacing its transcriptional terminator/polyadenylation segment of th
8、e 2H3 gene with an actin8 terminator/polyadenylation segment, yielding derived expression vector pMB74. The recombinant Dictyostelium strain called AX3-pLu8 was generated with this plasmid. When the recombinant cells were cultivated in a complex HL-5C medium, a cell density of 1.5-2107 mL-1 was reac
9、hed, and the shFasL level expressed by strains AX3-pCESFL95-G2, AX3-pCESFL95-H3 and AX3-pLu8 was 70 g L-1, 23.5 g L-1and 206 g L-1, respectively。 By using a newly developed synthetic medium called SIH as culture medium, higher cell density of 4-5107 mL-1 was achieved. Correspondently, 111 g L-1, 106
10、g L-1 and 420 g L-1 shFasL were secreted by recombinant strains AX3-pCESFL95-G2, AX3-pCESFL95 -H3 and AX3-pLu8, respectively. Keywords soluble human Fas ligand, Dictyostelium discoideum, Cultivation 引 言 人Fas配体(human Fas ligand, hFasL)是分子量为37KDa的同源三聚体型跨膜糖蛋白， 由一个胞内 N 端、一个跨膜片断和一个胞外 C 端组成1。它是一种细胞凋亡因子，属于
11、肿 瘤坏死因子(TNF)家族成员2,3。Fas 配体通过与细胞表面的 Fas 受体结合可引起 Fas 表达阳 性的细胞凋亡，或称之为程序性细胞死亡，从而杀死病变细胞4。FasL 也可以以可溶性形式 存在。可溶性 FasL 也具有生物活性，并可与它的膜结合形式竞争性调节细胞的凋亡5。近 年来随着研究的深入，发现 Fas 配体的凋亡作用在治疗肿瘤、AIDS、癌症、关节炎等疾病 方面有极其重要的作用，比如它可作为肿瘤生长的抑制因子。此外，Fas/FasL 系统在通过诱 导细胞凋亡来保持体内环境的平衡和淋巴细胞的自身忍耐力及免疫力的免疫调节中担当着 重要的角色。Fas 配体的缺失将导致淋巴增生及自身免
12、疫疾病6,7。 人 Fas 配体一般用动物细胞和人体细胞表达，由于这些细胞培养成本很高，且表达量 不高，因而人 FasL 产品价格昂贵。生产重组人 FasL 蛋白，可更好地了解 FasL 的生物功能， 并且可能大大降低生产成本，开发它在药物治疗方面的作用，如可应用于治疗慢性疾病。最 近，李宁丽等人在大肠杆菌中以融合蛋白的形式表达 hFasL，并制备出可用于检测患者血清 中可溶性 FasL 含量的抗 FasL 抗血清。所表达的 FasL 经透析复性后具有诱导 Jurkat 细胞凋 亡的活性8。但由于大肠杆菌不具备糖基化等翻译后修饰功能，所表达的重组蛋白不大可能 具有正确结构。 本文首次尝试利用粘
13、霉盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum, Dd)克隆表达可溶性人 Fas 配体(shFasL) 。 盘基网柄菌的主要优点在于它可对重组蛋白进行各种翻译后修饰， 如磷酸化、 酰基化、形成糖基磷脂酰肌醇锚点(GPI)，特别是氮连接或氧连接的简单和复杂的糖基化， 而且其糖基化机制与高等生物非常相似9。此外，可在盘基网柄菌中应用随机突变方法产生 3 成千上万个克隆子，从而避免了在昂贵而难处理的哺乳动物细胞系进行分析10。重组蛋白 在盘基网柄菌中是由染色体外质粒表达复制，而不是由整合到染色体上的 DNA 表达复制， 这样可一步得到重组蛋白以用于后续分析， 并且质粒的高拷贝数可使蛋
14、白质在可调节的启动 子的严格控制下以胞内、 膜结合或以胞外分泌的形式大量表达。 单细胞的阿米巴变形虫能够 在简单、廉价培养基上较快速生长并能在发酵罐中以较高的密度(1-2107 mL-1)悬浮培养， 利于重组蛋白的大量生产11。由于盘基网柄菌在表达糖蛋白上具有许多优越性，自 90 年代 初，它已被成功用于表达多种需要翻译后修饰的重组药用蛋白12，其中包括恶性症疾环子 孢子病毒蛋白抗原、血吸虫 S-谷胱甘肽转移酶、轮状病毒 SA11 毒株 VP7 蛋白、人抗凝血 酶 III 、人绒膜促性腺激素(hCG)13等十余种异源蛋白，并且这些重组蛋白均具有相应的体 内外生物活性，表达水平与在动物细胞系(如
15、 CHO)中表达相当或更高。 1 实验材料和方法 1.1 化学试剂化学试剂 酵母粉购自德国 Bioferm 公司，胰蛋白胨由 Difco 公司提供。酪蛋白胨、朊蛋白胨和葡 萄糖购自 Merck 公司，链霉素硫酸盐由 Sigma 公司提供，而遗传菌素则来自 Serva 公司。除 天冬酰胺酸购自 ICN、组氨酸购自 Senn、甘氨酸购自 Carl Roth 之外，实验所用的氨基酸大 多数来自日本 Ajinomoto 公司。维生素中除叶酸购自 Sigma 公司外，生物素、硫辛酸以及维 生素 B1、B2、B12 均来自 Fluka 公司。其余化学试剂均为分析纯级别以上的。 1.2 hFasL 基因片段
16、的扩增与克隆基因片段的扩增与克隆 从激活的人中性粒细胞中提取总 RNA，再进行逆转录得到编码可溶性 Fas 配体胞外区 第 141 个到第 281 个氨基酸的 cDNA, 随后经 PCR 扩增。用于扩增 FasL 基因片段的引物序 列分别为： 正向引物为 5-CTCGAGGTACCTGGGCTTCTAAGGAGCTG AGGAAAGTGG-3， 反向引物为 5-CTGCAGGATCCTTAGAGCTTATATAAGCCGAA-3（划线部分分别为 KpnI 和 BamHI 限制酶切位点）。所得 PCR 产物克隆到质粒 pGEM-T Easy (Promega) 中，并由 此得到质粒 pFLED。 1.3 hCG- 信号肽基因的扩增与克隆信号肽基因的扩增与克隆 Fas 配体一般是插入到细胞质膜中成为不具信号肽的型跨膜蛋
