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1、串潼畜牧菩翟学会动物繁殖学分会第十三震学术研讨会论文集 量舅皇皇曩皇舅皇量冀曼量麓曼舅量舅曼曼寰曼量墨皇鼍皇曼麓曼寰曼誉麓蔓舅皇曼篡曼冀II I 。一。一 I I 曼量麓皇曩皇鼍麓曼冀蔓曼皇量囊量罾黑曼崮蔓皇皇 利用乙醇高效激活0 P S 法玻璃化冷冻牛卵母细胞的研究 侯云鹏“2 刘颖2 戴蕴平2 李荣2 史文清王海平2 王莉莉2 李宁2 朱士恩屯昝 ( 1 、中国农业大学动物科技学院，2 、中豳农业大学生物学院农业生物技术国家重点实验塑) 捅要：本研究目的在于探讨O P S 法玻璃化冷冻牛卵母细胞的高效激活方法，以验证冷冻后卵 母细胞的发育能力。体外成熟培养1 6 h 和2 3 h 的卵母细
2、胞解冻后继续培养8 h 和l h 后进行激活对比， 卵裂率分别为3 7 4 和4 1 2 ，显著低于新鲜成熟2 4 h 卵母细胞( 7 7 5 ) ，囊胚率分剥为5 9 扣 2 3 2 ，但均与对照组( 4 2 0 ) 有显著性差异( P0 0 5 ) ；对5 一1 1 的不同体积浓度乙醇激活效 果进行比较发现，8 和9 体积浓度乙醇与6 - D M A P 的联合激活效果较好，卵裂率分别为5 2 2 和 6 1 1 ，囊胚率分别为2 8 9 和3 0 6 ，均无虽著性差异( P0 0 5 ) ；采用乙醇，钙离子栽体A 2 3 1 8 7 和离子霉素单独激活，单独激活卵裂率分别为2 2 8 ，
3、1 8 4 和2 7 7 ，囊胚率分别为1 2 2 ，8 5 和l l 。8 ；或单独激活后与6 - M D M A P 和C H X 进行联合激活处理，实验证明9 体积浓度乙醇与 6 - D M A P 联合处理组的激活效果最好。结果表明，t 随着乙醇浓度的提高，激活后卵裂率务囊胚率出 现先增后降的变化；9 体积浓度乙醇与6 D M A P 联合激活是冷冻牛卵母细胞激活的高效方法；体 外成熟培养2 3 h 卵母细胞相对于1 6 h 保存后细胞活力和体外发育能力较强，更适于冷冻保存。 关键词：乙醇玻璃化冷冻牛郛母细胞孤雌激活发育 近年来随着哺乳动物核移植研究的不断深入，对卵母细胞孤雌激活的研究
4、也口渐活跃，主要原 因是只有去核卵母细胞的充分激活才可指导移入核的重新编程，这是提高核移植效率的关键因素之 一。此外，研究哺乳动物卵母纲胞孤雌激活及体外发煮，有助予探索卵母细胞的生理反应，对予模 仿正常受精过程中卵母细胞激活、了解早期胚胎发育过程中父源基因组和母源基因组的作用都具有 重要的意义。研究发现，能诱发牛卵母细胞激活的刺激因素很多，如电脉冲f l 】、乙醇【2 】、钙离子载 体【3 】、放线菌酮( C H X ) 【4 ，5 】和离子霉素 6 】等，如采用叹上不同方法对卵母细胞进行联合处瑷则 效果更好【7 】。同样，在乙醇和离予霉素处理后立即采用蛋白酶抑止剂6 - - D M A P
5、联合处理也取得较 好的效果【8 】。尽管有着不同的作用机理，可通过模拟受精过程中精子诱发卵母细胞内C a 2 + 浓度节 律性脉冲升高却是相同的。至予联合处理效果较好的原因可能是更好地模拟了受精过程中糖子的激 活【9 】。 大多数实验室所使用的卵母细胞基本主来自于屠宰动物的卵巢，屠宰器6 小时内卵巢运到实验 室内，采集卵母细脆进行体外成熟培养。嘲予其受时闯和空间的限制，很难满足实验室进行大瓶模 常年的实验需求，而卵母细胞的冷冻保存是解决t 述问题的重要手段。自W h i t t i n g h a m 首次 z o N 用 慢速冷冻法成功地保存小鼠卵母细胞并获得产仔以来，迄今尽管人们在这方面做
6、了大量的研究工作， 但是卵母细胞冷冻保存的研究远不如胚胎冷冻保存的水平。 本实验以玻璃化冷冻保存的体外成熟牛卵母细胞作为研究对象，观察乙醇、离子霉素和钙离子 载体A 2 3 1 8 7 对卵母细胞的单独或与C H X 和6 D M A P 联合孤般激活矮的体外发育能力。 l 、材料与方法 1 1 卵母细胞采集及体外成熟培养 将屠宰场摘取的卵巢放入3 5 的生理盐水中带回实验室。用带有1 9 G 针头的1 0 m l 注射器抽吸 2 - - 一6 m m 卵泡中卵母细胞，在实体显微镜下选择带有完整致密的卵丘颗粒细胞和卵母细胞复合体 ( C O C s ) ，首先用T C M l 9 9 溶液洗3
7、 遍，再用N a H C 0 3 b u f f e r e dT C M 1 9 9 液洗两遍后移入成熟培养 液，置于二氧化碳培养籀中培葬。成熟培养1 6 h 或2 3 h 的卵母细胞在成熟培养液中吹打卵丘颗粒细 胞，以蠲鼹留有2 3 层颗粒细胞为宣。 孛匿畜牧营医学会动物繁殖学分会第十三届学术研讨会论文集 曼躺葛曼皇曼寰曼II ,I,毫 1 2 卵曝细胞玻璃化冷冻与解冻 首先将卵母细胞用O P S 管移入1 0 E + 1 0 D 溶液中平衡3 0 s 后，然后移入玻璃化溶液中平衡 2 5 s ，再将卵母细胞吸入O P S 管中直接投入液氮冷冻保存。每支管装入5 6 枚卵母细胞为宣。 O
8、P S 管由液氮中取出后，立即将含有卵母细胞部分直接浸入置予0 2 5 m o l L 蔗糖解冻液中，溶 解后将卵母细胞从O P S 管中吹出磐摇动混匀并平衡l m i n ，然后移入0 1 5 m o l L 蔗糖解冻液中平衡 5 m i n ，再用成熟培养滚洗涤2 次，移入成熟培养液中，在培养箱中继续培养至2 4 h 后供激活使沼。 l 。3 化学激活 1 3 1 单一激活 将解冻后卵母细胞成熟培养至2 2 2 4 h ，用无钙镁P B S 洗涤3 次后，分别放入5l a m o l LA 2 3 1 8 7 液中处理5 m i n ；5 1 1 乙醇中处理5 m i n ；2l a m
9、o l L6 D M A P 液中处理4 h ；1 0p g m Le y c l o h e x i m i d e 液中处理5 h 。洗涤3 次后放入C R l a a + 5 F B S 液中培养。 l 。3 2 联合激活 将解冻后卵母细胞成熟培养至2 2 2 镳，髑无钙镁P B S 洗涤3 次后，先放入5 1 a m o l LA 2 3 1 8 7 液 中处理5 m i n 或5 l l 乙醇中处理5 m i n ，再放入2 1 a m o l L6 一D M A P 液中处理4 h 或Z 0 0 9 m L c y c l o h e x i m i d e 液中处理5 l l 。
10、经洗涤3 次后放入C R l a a + 5 F B S 液中培养。 1 4 胚胎培养与发育 激活赢放入培养液培养为第0 天，每隔4 8 h 进行一半换液培养，于第2 天观察卵裂，没有卵裂 的不再计数，单独放入新培养液中培养2 3 天，卵裂的继续培养至第7 天观察囊胚发育情况并进行 胚胎细胞计数。 2 结栗与分析： 2 1 体外成熟时间对冷冻解冻后牛卵母细胞孤雌激活的影响 表2 1 体外成熟时嘲对冷冻解冻糟牛舞母缨胞孤雌激潘的影晌 注：为体外成熬的新簿卵母细胞；同一栏内不同上标( a ，b ，c ) 表示差异显著( p 0 0 5 ) ，但两个组均显著低于对照组( 7 7 。5 ，p 0 。0
11、 5 ) 。1 6 h 冻卵 激活的囊胚率最低( 5 9 ) ，与2 3 h ( 囊胚率2 3 2 ) 和对照组( 囊胚率4 2 。O ) 比较均有最著性差 异( 必0 。0 5 ) ，同样2 3 h 也与对照组的囊胚率有显著性差异( p 鹌。0 5 ) 。 2 2 乙醇浓度对冷冻勰冻盛牛卵母纲胞孤雌激活的影响 体铃成熟2 3 h 牛卵母细脆经O P S 法玻璃讫冷冻解冻后，用不同体积分数乙醇单独激活后卵裂率 为1 2 1 一2 7 7 ，囊胚率为1 1 - 1 5 8 。5 9 体积浓度单独激活的卵裂率和囊胚率显著高于 l O 1 1 条件下激活效果( p 0 0 5 ) 。9 体积浓度乙醇
12、单独激活卵裂率( 2 7 7 ) 效果最好，而 8 体积浓度乙醇单独激活囊胚率( 1 5 8 ) 最高。用不同体积分数乙醇与6 - D M A P 联合激活后卵裂 率为2 3 7 一6 1 1 ，囊胚率为5 。7 一3 0 。6 。80 A 和9 体积浓度乙醇与6 一D M A P 联合激活卵裂率 ( 分别为5 2 2 和6 1 。1 ) 效果显著优于其他组( p 0 。0 5 ) ，7 、8 和9 体积浓度乙醇与6 - D M A P 联合激活囊胚发育效果明显优于其他组( p 0 。0 5 ) ，并且随着体积浓度的升高囊胚发育率( 分秀j 为 2 5 1 、2 8 9 和3 0 。6 ) 呈
13、增长趋势。 乙醇体积浓度5 l l 条件下激活卵裂率变化趋势如图2 1 ，随着体积浓度的升高，无论单独 激活还是与6 - D M A P 的联合激活卵裂率均先出现上升趋势，在9 体积浓度乙醇时达到一个峰值， 中国畜牧兽医学会动物繁楚学分会第十兰矮学术研讨会论文集 m!,I I I I I I I , I I I I 曼曼麓曼寰皇曼燃曼鼍皇 ，： ：二 。+ 。卜、；二二妻 。王t 、 45 6789l Ol 王l2 乙醇体积浓度( ) L l ! 礓塑熬适竺乏堡，旦二D 螋联丛嘲 匿2 1 不阉浓度的乙醇对冷冻解冻后牛卵母细脆孤雌激活后郛裂静影确 量 三三三r ，三一_ 主- | 士、 薰；量
14、兰 Ip ：二 ： 一o - 长? | ： ：至碟l 卜- 薹 然后开始出现下降趋势。乙醇体积浓度5 , - - , 1 1 条件下激活囊胚率变化趋势如图2 2 ，随着体 积浓度的升高，无论单独激活还是与6 D M A P 的联合激溅囊胚率均先出现上升趋势，单独激活在8 体积浓度乙醇时达到一个峰值，丽与6 一D M A P 的联合激活在9 体积浓度时达到一个峰值，然后 出现下降趋势。 2 3 激活方法对冷冻解冻后牛卵母细胞孤雌激活的影响 采用几种目前常用于激活牛卵母细胞的化学试剂组合形成9 种激活方法，不同激活方法激活后 发育情况如表2 2 。9 乙醇激活5 m i n 后与6 。D M A
15、P ( 4 h ) 的联合激活方法卵裂率最高( 5 9 9 ) ， 但与9 乙醇( 5 r a i n ) 及C H X ( 5 h ) 联合激活组( 4 9 。5 ) 和离予霉素( 5 m i n ) 及6 。D M A P ( 4 h ) 联合激活组( 5 2 。8 ) 没有显著性差异。单独激活时离子霉豢的最好激活效果卵裂率为2 7 7 ，所 有单独激活的卵裂率均显著低于联合激活( p o 。0 5 ) ，尽管6 一D M A P 与其蚀试荆联合激活的效果很好， 但单独激活时的卵裂率在所有组中最低( 1 5 8 ) 。9 乙醇和离子霉素与6 D M A P 酶联合激活囊胚 2 5 8 O O O O O O O 0 O O O O O O G O 7 6 5 4 3 2 圭 X v 瓣群器 巾国誊牧尊医学会动物繁殖学分会第十兰属学术研讨会谂文集 发育率在9 个组中较高，分别为3 0 2 和2 6 2 ，褪二者没有统计学差异。6 - D M A P 和C H X 单独 激活的胚胎发弯能力很差，6 - D M A P 组没有胚胎能够发育到囊胚，C H X 组的囊坯发育率仅为4 。5 。 所有联合激活组的囊胚发育率显著优于单独激活组( p 0 0 5 ) 。 表2 2激活方法对玻璃纯冷冻一解冻看卵母细脆经不同方法孤雌激活看的释胎体外发商率 注：
