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1、第二军医大学 博士学位论文 SOCS1基因修饰的骨髓树突状细胞对同种移植排斥的治疗作用及 其机理 姓名：宋少华 申请学位级别：博士 专业：外科学（普外肝） 指导教师：傅志仁;丁国善 20100501 S O C S l 基因修饰的小鼠骨髓树突状细胞对同种移植排斥的治疗作用及其机理 摘要 目前，器官移植已经成为治疗各种脏器终末期疾病的唯一、有效治疗手段。许多患 者通过移植同种异体器官获得新生。然而，外来器官进入机体后不可避免地会激发受者 的免疫系统，产生针对移植器官的免疫应答以及排斥反应。多种新型免疫抑制剂的临床 应用，虽然降低了移植排斥反应的发生率，但仍然存在两大问题：其一，免疫抑制剂并 不能
2、完全抑制排斥反应的发生；其二，长期应用免疫抑制剂存在诸多不良反应，包括药 物的毒性、过度抑制机体免疫力造成的感染及新生肿瘤等。因此，抑制同种移植排斥反 应并诱导机体对供者抗原的特异性免疫耐受，使机体保持正常的免疫力以抵抗微生物等 病原体感染及肿瘤的发生，是解决器官移植排斥反应的最佳途径，也是移植领域研究的 热点之一。 树突状细胞( d e n d r i t i cc e l l s ，D C ) 是一类功能强大，并且是唯一能够激活初始T 细胞的抗原提呈细胞，在识别和提呈抗原、启动免疫应答、诱导移植排斥反应中起着重 要的作用。然而，近年来的研究表明D C 是一类异质性细胞群体，具有不同的亚群和
3、不 同的功能状态，不但在增强免疫反应上具有重要的作用，也具有抑制排斥反应、诱导特 异性免疫耐受的潜力。有研究表明，未成熟D C 缺乏共刺激分子C D 8 0 ( B 7 1 ) 和C D 8 6 ( B 7 - 2 ) 的表达，体外能够诱导同种抗原特异性的T 细胞失能。然而，体内未成熟D C 存在着自然发育成熟的内在机制，同时，器官移植术后受者体内产生的多种介质，如致 炎性细胞因子、L P S 等，均能促进D C 分化成熟，使之拥有强大的免疫原性。因此，某 些体外调控手段，如免疫抑制分子1 , 2 5 二羟维生素D 共培养或白细胞介素1 0 ( i n t e r l e u k i n 10
4、 ，I L 一10 ) 、转化生长因子p ( t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r - 1 3 ，T G F p ) 等基因 修饰，可以使D C 维持于稳定的不成熟状态，增强其耐受原性，是减轻移植排斥反应、 诱导特异性免疫耐受的重要途径并具有潜在的临床应用价值。 细胞因子信号抑制因子l ( s u p p r e s s o ro f c y t o k i n es i g n a l i n g l ，S O C S l ) 作为负性调节 细胞因子J a n u s 激酶信号传导和转录活化因子( J a n u sk i n a s e
5、 s i g n a lt r a n s d u c e ra n d a c t i v a t o ro ft r a n s c r i p t i o n , J A K S T A T ) 信号途径的蛋白而被发现，可以抑制Y 干扰素 ( i n t e r f e r o n 吖，I F N 吖) 、I L 6 、生长激素( g r o w t hh o r m o n e ，G H ) 等细胞内信号传导。新 的研究显示S O C S l 对D C 的成熟和功能具有重要的调控作用，源于S O C S l 斗小鼠的脾 脏D C 与正常D C 相比，表达高水平共刺激分子，对I L 4
6、、I F N 吖刺激呈明显高反应， 刺激B 细胞的增殖作用更加强烈。负载抗原的S O C S I D C 和正常D C 分别注射到同一 只小鼠不同足垫，前者能够激发小鼠足垫区域引流淋巴结更加强烈的T h l 型反应，该淋 巴结分离的T 细胞能够产生更高水平的I F N q , 。S O C S l 基因沉默的D C 负载卵白蛋白 ( o v a l b u m i n , O V A ) 后，体内、外均能更有效地刺激O V A 特异性T 细胞的增殖反应及 细胞毒性作用。S O C S I 基因沉默D C 以及S O C S l 斗D C 具有更强的免疫刺激功能以及打 第二军医大学博士学位论文
7、破自身耐受的能力。鉴于S O C S l 基因对D C 发育及免疫功能的重要调控作用，我们设 想采用基因转染技术体外增加未成熟D C 内S O C S l 基因的表达将会减缓或阻止D C 的 成熟过程，体内回输有利于减轻排斥反应，并可能诱导稳定、有效的供者特异性免疫耐 受。 本文通过体外培养、扩增并富集小鼠骨髓来源的D C ，并借助复制缺陷型腺病毒载 体将S O C S l 基因转入D C ，研究S O C S l 基因修饰的未成熟D C 的表型及功能的变化以 及体外诱导同种抗原特异性T 细胞低反应性的作用和效果；通过建立小鼠同种异体异位 心脏移植模型，观察S O C S l 基因修饰的未成熟
8、D C 体内减轻排斥反应、诱导心脏移植 免疫耐受的效果，并探讨了可能的机制。 第一部分小鼠骨髓树突状细胞体外培养及S O C S I 基因转染 D C 起源于骨髓，在体内分布广泛，但含量极少，不足外周血单核细胞的1 。体 外培养D C 可以为基础科研和临床治疗提供丰富的D C 来源。我们采用重组小鼠粒巨噬 细胞集落刺激因子( r e c o m b i n a n tm o u s eg r a n u l o c y t e m a c r o p h a g ec e l lc l o n es t i m u l a t ef a c t o r , r m G M C S F ) 和r
9、 m l L 4 共同刺激新鲜分离的小鼠骨髓细胞，培养小鼠骨髓来源D C ，并 根据小鼠骨髓来源D C 高表达相对特异性表面分子C D Il c ，采用针对C D ll c 免疫磁珠 分离法进一步富集D C 。结果显示，刚制备的骨髓细胞极少有成簇或有树枝状突起的细 胞，培养3 天后有的散在克隆形成，带树枝状突起的细胞逐渐增多，培养5 天后克隆较 多，细胞的突起逐渐明显，成典型的未成熟D C 表现。经免疫磁珠分离富集后，可以得 到足够数量的D C ，其纯度可以高达9 3 以上。 腺病毒载体具有基因组结构简单、病毒滴度高、感染效率高、宿主细胞范围广、无 插入突变等优势，因此我们构建了编码S O C
10、 S l 基因的复制缺陷型腺病毒载体 ( A d S O C S I ) ，P C R 、特异性酶切、测序鉴定以及W e s t e r nB l o t t i n g 等方法的检测结果 已经证实，A d S O C S l 载体构建成功，可以表达S O C S l 蛋白。经过病毒扩增和滴度的 检测，可以获得较高滴度的A d S O C S l 载体。收获富集后的D C ，按复合感染指数( M O I ) 1 ：1 0 0 加入A d S O C S I 或A d G F P 病毒，未经病毒转染的未成熟D C 作为对照。将上述 三种细胞分别称为D C S O C S l 、D C G F P
11、 、i m D C ( 未成熟D C ) 。流式细胞仪分析D C G F P 组对照病毒载体转染效率；荧光实时定量P C R 及W e s t e r nB l o t t i n g 检测各组D C 内S O C S l 基因的m R N A 和蛋白表达。结果显示对照病毒载体A d G F P 的转染效率可以达到7 0 以上；与i m D C 组及D C G F P 组相比，D C S O C S l 组S O C S I m R N A 和蛋白表达水平明 显升高( p 0 0 5 ) ，但L P S 刺激后D C S O C S l 分泌I L 1 2 较i m D C 及 D C G F
12、 P 明显降低( p 0 0 1 ) ，而D C - S O C S l 分泌l L 1 0 水平在L P S 刺激前或后均较i m D C 或D C G F P 明显升高( r K o 0 1 ) 。上述结果表明通过基因转染技术增加未成熟D C 内 S O C S l 表达，可阻断外源性L P S 对D C 的成熟刺激作用，使之维持在稳定的未成熟状 态。 通过F I T C D e x t r a n 吞噬实验检测各组D C 的抗原吞噬功能，发现L P S 刺激前各组 D C 均具有较强的吞噬能力，L P S 刺激后，i m D C 及D C G F P 的吞噬能力明显降低， D C S O
13、 C S l 的吞噬能力仅有轻度下降；进一步检测各组D C 的抗原提呈功能，发现 D C S O C S l 抗原提呈能力明显低于i r n D C 和D C G F P 组( p 0 0 1 ) 。上述结果表明S O C S I 基因修饰可以使D C 维持较强的抗原吞噬能力并抑制D C 抗原提呈功能。 通过M L R 分析各组D C 的免疫刺激活性，发现S O C S l 基因修饰的D C 刺激同种 C D 4 + T 细胞增殖的能力明显减弱( p O 0 1 ) ；检测同种M L R 反应体系上清中细胞因子 水平，发现D C S O C S I 组T h l 型的细胞因子I F N - T
14、 水平明显降低( p 0 0 1 ) ，T h 2 亚群 的细胞因子I L 1 0 水平明显升高( p O 0 1 ) ；进步行细胞内细胞因子染色，结果表明 D C S O C S l 刺激的同种C D 4 + T 细胞，细胞内I L 1 0 表达水平明显升高。上述结果表明， S O C S l 基因修饰的D C ，免疫刺激功能明显降低，可抑制T h l 亚群的分化，促进免疫反 应向T h 2 偏移，并促进I L 1 0 分泌性T 细胞的产生，能够诱导同种T 细胞低反应。 进一步研究S O C S l 基因修饰的D C 体外诱导同种抗原特异性T 细胞低反应性。在 初次M L R 中接受C 5
15、7 B L 6 来源的D C ，S O C S l 刺激的B A L B c 脾脏C D 4 + T 细胞，在二 第二军医大学博士学位论文 次M L R 中再次接触同种抗原时，表现出明显较低的反应性( p 0 0 5 ) ，表明S O C S l 基因修饰的D C 诱导的T 细胞低反应性具有同种抗原特异性。上述结果提示S O C S l 基因修饰的D C 免 疫后有可能减轻移植排斥反应并诱导受者对同种移植器官的免疫耐受。 第三部分S O C S I 基因修饰的树突状细胞治疗同种移植排斥的效果和免疫学机制 为进一步观察S O C S l 基因修饰的D C 体内环境下是否具有减轻移植排斥反应并诱
16、导免疫耐受的作用，我们将C 5 7 B L 6 小鼠来源的i m D C 、D C G F P 以及D C S O C S l 免疫 B L A L B c 小鼠后，采用同种小鼠颈部异位心脏移植模型，研究S O C S l 基因修饰的D C 体内治疗同种排斥反应、诱导免疫耐受的效果，并分析了可能的机制。 将体重在2 0 - - 2 2 克、周龄相同的B A L B c 小鼠，随机分成四组，每组8 只，作为受 者。在心脏移植术前第7 天，3 组B A L B c 受者小鼠分别经静脉注入2 x 1 0 6 个C 5 7 B L 6 供者来源的i m D C 、D C G F P 或D C S O C S I ，并设经尾静脉注入等量P B S 的B A L B c 受 者小鼠为P B S 对照。四组受体小鼠分别于同一条件下接受C 5 7 B L 6 供者心脏的颈部异 位移植。另设姊妹组，在心脏移植后第7 天及第1 5 天处死受者小鼠，
