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1、华中科技大学 硕士学位论文 HBx基因影响HepG2细胞生物学特性及DNA修复酶hMTH1、 hMYH与hOGG1表达的实验研究 姓名：郭晓榕 申请学位级别：硕士 专业：内科学（消化疾病） 指导教师：程斌;田德安 20090501 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 1 HBx 基因影响基因影响 HepG2 细胞生物学特性及细胞生物学特性及 DNA 修复酶修复酶 hMTH1、hMYH 与与 hOGG1 表达的实验研究表达的实验研究 硕士研究生：郭晓榕 导 师：程 斌 副教授 田德安 教 授 摘摘 要要 目的目的 （1） 观察 HBx
2、基因对 HepG2 细胞增殖、周期和凋亡等生物学特性的影响，初步探讨 细胞周期蛋白 p21 在其中的作用和意义。 （2） 观察构建的 HBx 转基因细胞模型 HepG2/HBx 中 8-OHdG 含量及 DNA 修复酶 hOGG1, hMYH,hMTH1 mRNA 表达的改变，从 DNA 修复酶这一新的角度探讨 HBx 在肝细胞癌发生机制中的作用。 方法方法 （1） 以四唑蓝（MTT）比色法检测 HBx 转基因细胞 HepG2/HBx 及对照组 HepG2 与 HepG2/pcDNA3.1 细胞（转染空载体 pcDNA3.1 的 HepG2 细胞）的增殖情况。 （2） 流式细胞术检测 HepG
3、2/HBx 及对照组细胞的周期和凋亡情况，并以半定量 RT-PCR 检测各组细胞中细胞周期蛋白 p21 mRNA 的表达。 （3） 应用 HPLC/ECD 法检测稳定表达 HBx 的转基因细胞 HepG2/HBx 及其对照组 HepG2 与 HepG2/pcDNA3.1 细胞中的 8-OHdG 的含量。 （4） 以 -actin 为内对照， 应用 RT/实时 PCR 定量检测 DNA 修复酶 hOGG1， hMYH， hMTH1 mRNA 在 HepG2/HBx 细胞，对照组 HepG2 细胞与空质粒对照组 HepG2/pcDNA3.1 细胞中的表达。 结果结果 （1） MTT 比色法显示 H
4、epG2/HBx 细胞生长速度加快；流式细胞术检测发现 HepG2/HBx 中 G0/G1 期 细 胞 比 例 较 对 照 组 显 著 减 少 （ 43.343.11% vs 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2 57.694.28%, P0.01） ，S 期细胞比例明显增加（28.691.17 % vs 22.411.99%, P0.05） ，同时还发现与对照组相比其凋亡率也显著降低（1.190.06% vs 5.430.42%, P0.001） 。半定量 RT-PCR 的结果表明细胞周期蛋白 p21 mRNA 在 HepG2/H
5、Bx 细胞中的表达较对照组细胞显著降低 (0.160.05 vs 0.780.15, P0.001)。 （2） 8-OHdG在HepG2/HBx 细胞中的含量显著高于对照组 HepG2 和HepG2/pDNA3.1 细胞（36.56.25 vs 8.521.65 fmol 8-OHdG/g DNA, P0.05） 。 （3） RT/实时 PCR 定量检测发现 DNA 修复酶 hMTH1 在 HepG2/HBx 细胞中的表达显 著 高 于HepG2和HepG2/pcDNA3.1 细 胞 （ 1.2130.100 vs 0.0870.026 hMTH1/-actin mRNA100,P0.05）
6、，相反 DNA 修复酶 hMYH 在 HepG2/HBx 细胞中的表达却明显低于 HepG2 和 HepG2/pcDNA3.1 细胞（0. 0210. 007 vs 0.0990.041 hMYH/-actin mRNA100,P0.05)。 结论结论 （1） HBx 基因可能具有加速 HepG2 细胞周期进程、促进细胞增殖以及抑制细胞凋亡 的作用,并可参与下调细胞周期蛋白 p21 mRNA 表达的过程。 （2） HBx 可能通过诱导氧化应激增加 HepG2 细胞内 DNA 氧化损伤产物 8-OHdG 的 含量，从而上调 DNA 修复酶 hMTH1 mRNA 的表达；同时 HBx 可抑制 hM
7、YH mRNA 的表达，影响细胞核酸切除修复功能而参与肝细胞癌的发生和发展。 关键词关键词 HBx 基因；基因；p21； HPLC/ECD；RT/实时实时 PCR；hOGG1；hMYH；hMTH1 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 3 Experimental study of the effects of HBx gene on the Biological Features and the expression of DNA repair enzymes hMTH1、hMYH and hOGG1 mRNA in the HepG
8、2 cells Postgraduate： Guo Xiao-rong Tutor： Vice-prof Cheng Bin Prof Tian De An Abstract Objective （1） To study the effect of HBx on cell cycle, proliferation and apoptosis of HepG2 cells as well as the potential regulative role of p21. （2） To study the variation of 8-OHdG levels and the expression o
9、f DNA repair enzyme hOGG1, hMYH, hMTH1 mRNA in the gene-transfected cell strain HepG2/HBx and explore the mechanisms of hepatocellular carcinoma from the new viewpoint of DNA repair enzyme. Methods （1） MTT assay were adopted to measure the proliferation of HepG2/HBx, HepG2 and HepG2/pcDNA3.1(HepG2 c
10、ells transfected with pcDNA3.1) cells. （2） Flow cytometry were adopted to measure the cell cycles and apoptosis of HepG2/HBx, HepG2 and HepG2/pcDNA3.1 cells. Semi-quantified RT-PCR was used to evaluate the expression of p21 in three groups. （3） 8-OHdG levels were detennined by HPLC/ECD in the establ
11、ished gene-transfected cell strain HepG2/HBx and the control cells HepG2 and HepG2/pcDNA3.1. （4） Using the -actin as the interior control, Real-time quantitantive polymerase chain reaction (Real-time qPCR) was employed to examine the expression of DNA repair 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学
12、 位 论 文 4 enzyme hOGG1, hMYH and hMTH1 mRNA in the HepG2/HBx and the control cells HepG2 and HepG2/pcDNA3.1. Results （1） MTT assay demonstrated that the proliferation of HepG2/HBx cells has been accelerated. Flow cytometry found that the proportion of HepG2/HBx cells decreased in G0/G1 phase (43.34%3
13、.11% vs 57.694.28%, P0.01), but increased in S phase (28.69%1.17 % vs 22.41%1.99%, P0.05) and the apoptosis rates of HepG2/HBx cells were at a lower level (1.19%0.06% vs 5.43%0.42%, P0.001) Compared with HepG2 and HepG2/pcDNA3.1 cells. The expression of p21 mRNA in HepG2/HBx was down-regulated (0.16
14、0.05 vs 0.780.15, P0.001). （2） Our results show that the 8-OHdG level in the HepG2/HBx is significantly higher than that in HepG2 and HepG2/pcDNA3.1 （36.56.25 vs 8.521.65 fmol 8-OHdG/g DNA, P0.05）. （3） Our results show that the expression level of DNA repair enzyme hMTH1 mRNA in the HepG2/HBx is sig
15、nificantly higher than that in HepG2 and HepG2/pcDNA3.1 cells（1.2130.100 vs 0.0870.026 hMTH1/-actin mRNA100,P0.05）. In contrast, the expression of DNA repair enzyme hMYH mRNA in the HepG2/HBx is lower than that in HepG2 and HepG2/pcDNA3.1 cells （0. 0210. 007 vs 0.0990.041 hMYH/-actin mRNA100,P0.05). Conclusions （1） The HBx gene can down-regulate the expression of p21 mRNA, which may play an important role in accelerating the cell cycles, improving the growth and inhibitting the apoptosis. （2） HBx gene may increase the oxidative DNA-adduct 8-OHdG by promoting the oxidative
