hbcag基因修饰的dc疫苗抗hbv的实验研究

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1、 浙江大学博士学位论文 1 英文缩写注释表 英文缩写注释表 英文缩写英文缩写 英文全称英文全称 中文全称中文全称 HBV Hepatitis B virus 乙型肝炎病毒 CTL Cytotoxic T Lymphocyte 细胞毒性 T 细胞 DC Dendritic cell 树突状细胞 APC Antigen presenting cells 抗原提呈细胞 Tg Transgenic mice 转基因小鼠 AdV or Ad Adenovirus 腺病毒 MHC Major histocompatibility complex 主要组织相容性复合体 GM-CSF Granulocyte

2、macrophage 集落刺激因子 -colony stimulating factor IL Interleukin 白细胞介素 TNF- Tumor necrosis factor- 肿瘤坏死因子 IFN- Interferon- -干扰素 MLR Mixed lymphocyte reaction 混合淋巴细胞反应 HBsAg Hepatitis B virus surface antigen 乙肝病毒表面抗原 HBcAg Hepatitis B virus core antigen 乙肝病毒核心抗原 MOI the multiplicity of infection 感染重数 CPE

3、细胞病变效应 Ad-C HBcAg 重组腺病毒 DC/Ad-C Ad-C 转染的 DC DC/HBcAg HBcAg 蛋白冲击的 DC 浙江大学博士学位论文 2 HBcAg基因修饰的DC疫苗抗HBV的实验研究 博士生：贾红宇博士生：贾红宇 导导 师：陈师：陈 智智 教授教授 专专 业：内科学（传染病学）业：内科学（传染病学） 中中 文文 摘摘 要要 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV）感染是引起世界范围内乙型肝炎 的高发病率和死亡率的主要原因。HBV 慢性携带者成为慢性肝炎、肝硬化和肝 细胞癌发病的高危人群。 免疫耐受机理的形成是乙型肝炎慢性化的中心环节，而免疫耐受的形

4、成一 般与病毒和宿主两方面因素有关。机体对病毒的免疫应答结果的差别决定是否 造成 HBV 持续感染，而抗原、抗原提呈细胞和淋巴细胞是决定免疫应答结果的 三个主要因素。 持续 HBV 感染者以弱而窄谱的特异性 CD8+细胞毒性 T 细胞（Cytotoxic T Lymphocytes, CTLs）细胞应答为特征，并且他们外周血单核细胞来源的树突状 细胞（Dendritic cells, DCs）存在抗原提呈功能缺陷。因此，免疫治疗增强慢性 感染者抗 HBV 的 T 细胞应答有望结束持续病毒感染。 HBV 转基因小鼠（Transgenic mice, Tg）是一种持续 HBV 感染模型，是评 价打

5、破耐受和结束 HBV 持续感染的免疫治疗策略的良好实验模型。 乙型肝炎病毒核心蛋白（HBV core antigen, HBcAg） ，是乙肝病毒表达的抗 原中免疫原性最强的抗原。 HBcAg 可以 T 细胞依赖性抗原和 T 细胞非依赖性抗 原两种形式发挥作用。HBcAg 可以优先诱导出 Th1 型细胞免疫反应。在慢性 HBV 感染中，HBcAg 唯一能够引发显著免疫反应的抗原。 本研究通过构建 HBcAg 重组腺病毒载体(AD-C)，体外转染小鼠 DC，观察 浙江大学博士学位论文 3 其与 HBsAg 重组腺病毒载体 （AD-S） 体内外免疫刺激活性及抗 HBV 免疫功能， 并研究和评价两种

6、腺病毒载体-DC 疫苗在 HBV 转基因小鼠中诱导抗 HBV 免疫 的作用特点及其对 HBV 持续感染的可能治疗作用和应用前景， 为该疫苗用于慢 性乙型肝炎的治疗提供实验和理论依据。 本研究分三部分。 第一部分 HBcAg 重组腺病毒载体的构建及鉴定 第一部分 HBcAg 重组腺病毒载体的构建及鉴定 研究目的研究目的 构建能高效转导 HBcAg 基因的重组腺病毒，进行病毒扩增和滴度测定，并 检测转导率和 HBcAg 抗原表达，以用于基因治疗的实验研究。 方方 法法 应用AdEasyTM XL腺病毒载体系统构建表达HBcAg的重组腺病毒 （Ad-C） 。 所用载体为删除 E1 和 E3 基因的复

7、制缺陷 5 型腺病毒。目的基因首先克隆到 p-shuttle-CMV 形成穿梭载体，用 Pme I 酶切使之线性化，经电转化到 BJ5183-AD-1 细胞中形成重组腺病毒质粒， 后者被 Pac I 酶切鉴定为阳性重组子 后，再以 Pac I 酶切线性化，转染到 AD293 细胞包装为重组腺病毒（rAd） 。病 毒颗粒在 AD293 细胞中进一步扩增。最后，用 Reed-Muench 法测定病毒颗粒滴 度。 用流式细胞分析 Ad-GFP 转染的 DC 的荧光表达， 放免法和 Western Blotting 法检测 Ad-C 转染的 DC、CHO 和 P815 细胞 HBcAg 的表达。 结结

8、 果果 1. PCR 和核苷酸序列分析均显示， 穿梭载体和重组腺病毒质粒均含有完整和正 确的 HBV C 基因序列。 2. 通过 Reed-Muench 法测定第二代重组腺病毒滴度（TCID 50/mL）结果 Ad-C 浙江大学博士学位论文 4 为 108/ml。 3. Ad-GFP 以 MOI 为 100 转染小鼠骨髓来源的 DC 细胞， 用流式细胞仪检测荧 光表达率为 93.723.01（%） ，荧光强度（MnX）达 246.1843.81。 4. 放免法和 Western Blotting 法检测 Ad-C 转染的 DC、CHO 和 P815 细胞裂解 上清 HBcAg 均为阳性，而细胞

9、培养上清 HBcAg 大多为阴性。 结结 论论 1. 成功构建了复制缺陷型 HBcAg 重组腺病毒（Ad-C） 。 2. 重组腺病毒Ad-C能高效转染HBV C基因并主要在被转染细胞内有效表达目 的蛋白。 第二部分 比较 第二部分 比较 HBcAg 和和/或 HBsAg 重组腺病毒转导的小鼠树突状细胞体内外 免疫功能的研究 或 HBsAg 重组腺病毒转导的小鼠树突状细胞体内外 免疫功能的研究 研究目的研究目的 研究HBcAg+/-HBsAg重组腺病毒转导的小鼠DC细胞的体内外免疫刺激活 性， 并与 HBcAg 蛋白冲击 DC 和 DNA 疫苗比较其诱导抗 HBV 免疫的作用及特 点，探讨 DC

10、/Ad-C 和/或 DC/Ad-S 作为 HBV 持续感染的治疗性疫苗的可行性。 方方 法法 BALB/c (H-2d)小鼠的骨髓细胞体外与 GM-CSF、 IL-4 和 TNF- 共培养 7 天， 形成小鼠骨髓来源的 DC， 转染重组腺病毒 (Ad-C, Ad-S, Ad-C+Ad-S 或 Ad-lacZ) 或 HBcAg 蛋白冲击后用于体内外实验。流式细胞术分析重组腺病毒转染 (DC/Ad-C, DC/Ad-S, DC/Ad-C+Ad-S 和 DC/Ad-lacZ)或 HBcAg 冲击的 DC （DC/HBcAg）表型，同种异体和自体混合淋巴细胞反应（MLR）检测 DC 的 刺激活性，并以

11、流式细胞术分析自体 MLR 中增殖 T 细胞内细胞因子。 浙江大学博士学位论文 5 DC 免疫，1x106DC 细胞/100 l/只，BALB/c 小鼠尾静脉注射，PBS(4 只) 未处理 DC 对照（4 只） ，DC/HBcAg（10 只），DC/Ad-C（10 只）, DC/Ad-S （10 只）, DC/Ad-C+Ad-S(10 只)，rAd 对照 DC/Ad-lacZ（4 只）；DNA 免疫， 100 g/50 l/只，双后肢肌肉多点注射，pcDNA3.1(+)-C（8 只） ，pcDNA3.1(+) 对照（4 只） 。间隔 3 周后再相同免疫一次。流式细胞术检测免疫后小鼠脾脏 T 细

12、胞内细胞因子，LDH 释放法测定脾细胞 HBcAg 特异性 CTL 活性，放免法检 测血清抗-HBc 和抗-HBs。 结结 果果 1. 经流式细胞术分析后表明， DC/HBcAg、 DC/Ad-C、 DC/Ad-S、 DC/Ad-C+Ad-S、 DC/Ad-lacZ 和未处理 DC，表面 CD11c、DEC-205、MHC I 类和类分子、 CD80、CD86、CD40、CD54 等表达增强，为成熟 DC 表型，并且各组间没 有显著差异（p0.05）。 2. 无论是同种异体还是自体 MLR，各组 DC 刺激 T 细胞增殖的功能没有显著 差异（p0.05）。 3. 经 DC 细胞刺激后，自体 M

13、LR 中 CD3+CD8-Th 和 CD3+CD8+Tc 细胞均以分 泌 IFN- 为主，表现为 Th1/Tc1 型。各组 DC 的这种作用没有显著性差异 （p0.05）。 4. 在免疫后 2 周， 所有的 rAd 转导 DC 和 DC/HBcAg 比 DNA 疫苗诱导更多 Th 分泌 IFN-，即诱导更强的 Th1 应答（p0.05），并且 DC/Ad-C +/- Ad-S 显 著高于其它处理组，有统计学意义（p0.05）；所有 rAd 修饰的 DC 比 DC、 DC/HBcAg 及 DNA 疫苗诱导更多 Tc 分泌 IFN-，即诱导更强的 Tc1 反应 （p0.05）。免疫小鼠后 4 周，

14、rAd 修饰的 DC 比 DC/HBcAg 及 DNA 疫苗 诱导更多 Th 分泌 IFN-,但无显著意义（p0.05）；rAd 修饰的 DC 比 DC/HBcAg 及 DNA 疫苗诱导更多 Tc 分泌 IFN-，有显著性差异（p0.05）。 5. 免疫后 2 周， 在各种效靶比中， DC/Ad-C+Ad-S 组 、 DC/Ad-C 组、 DC/Ad-S 组、DC/HBcAg 组和 pcDNA3.1(+)-C 组的 CTL 活性仍依次递减，并且各组 间差异有统计学意义（p0.05）；另外 4 组 CTL 活性很弱。免疫后 4 周，在 浙江大学博士学位论文 6 各种效靶比中， DC/Ad-C+A

15、d-S 组 、 DC/Ad-C 组、 DC/Ad-S 组、 DC/HBcAg 组和 pcDNA3.1(+)-C 组的 CTL 活性仍依次递减，DC/Ad-C 组和 DC/Ad-S 组 在效靶比为 10：1 时有显著差异（p0.05）。其余各组间均有显著性差异 （p0.05）。 6. pcDNA3.1(+)-C诱导的抗体应答 （抗HBc） 在免疫后比DC/HBcAg和DC/Ad-C 疫苗强。DC/Ad-C+Ad-S 组和 DC/Ad-S 组未诱导出明显的抗体应答（抗 -HBs） 。 结结 论论 1. 证实 Ad-C、Ad-S、Ad-C+Ad-S 体外转导的小鼠 DC 不影响 DC 表型成熟、 同种异体和自体 T 细胞刺激活性及诱导 Th1/Tc1（型）细胞应答的作用。 2. Ad-C 转导的 DC 免疫小鼠后能增强小鼠 I 型免疫应答，诱导比 DNA 疫苗更 强的 Th1 细胞应答，以及比 HBcAg 蛋白冲击 DC 和 DN