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1、华中科技大学 博士学位论文 活化小胶质细胞参与癫痫发病的作用机制研究IL-1的重 要作用 姓名：郑红花 申请学位级别：博士 专业：人体解剖学与组织胚胎学 指导教师：李正莉 20090501 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 1 活化小胶质细胞参与癫痫发病的作用机制研究 活化小胶质细胞参与癫痫发病的作用机制研究 IL-1 的重要作用的重要作用 博士研究生 郑红花 导师 李正莉 教授 华中科技大学同济医学院解剖学系 武汉 430030 中中 文文 摘摘 要要 小胶质细胞（microglia, MG）广泛分布于中枢神经系统，正常状态下，M
2、G 处于 静止状态，行使免疫监视功能。近年研究表明，在大量神经退行性疾病如帕金森病 （PD）、阿尔茨海默病(AD)、亨廷顿病(HD)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)等的发生、发 展过程中均观察到 MG 的活化和分泌活动的异常。我们前期的研究也曾证实，在临床 外科手术切除颞叶癫痫灶的标本中，有大量增生和激活的 MG，提示 MG 与癫痫的发 病密切相关。另据报道很多细胞因子与癫痫的发病有关，如 IL- 1 和 IL- 6 在致痫大鼠 大脑皮质及海马内表达增加；而在 MG 与神经元混合培养的体外实验研究中，用脂多 糖（lipopolysaccharide，LPS）或干扰素- （interferon- ，
3、ITF- ）活化的 MG 与神经元 混合培养可加剧神经元损伤，加入 IL- 1 受体拮抗剂（receptor antagonist，IL- 1ra）或 NMDA 受体拮抗剂 MK- 801 后可显著改善这种效应， 表明 NMDA 受体和 IL- 1 受体均 参与了 MG 介导的神经毒性。 虽然目前已关注到癫痫的病理机制与 MG 之间有密切的关系，但在癫痫病程中， 活化的 MG 通过何种途径或物质影响神经元的兴奋性尚未彻底阐明。 根据上述提示的 研究资料我们推测，活化的 MG 有可能通过产生和分泌过量的生物活性物质，包括 IL- 1，而参与癫痫的病理过程。因此，本研究以海人酸（kainic ac
4、id, KA）为激活剂， 以美满霉素（minocycline）为抑制 MG 活化的工具药，以 IL- 1 抗体或 IL- 1 受体拮抗 剂拮抗 IL- 1 的效应，通过离体和在体实验，模拟癫痫发作时 MG 的活化状态，探讨 MG 活化后及所产生的 IL- 1 在癫痫发生发展中的作用及相关机制，以期为癫痫发病 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 2 机制研究提供新的实验资料，为抗痫药物研制提示新的作用靶点。本研究共分四个部 分。 第一部分、第一部分、KA 对对 MG 的激活作用及与的激活作用及与 IL-1 产生的关系产生的关系 为了探讨
5、癫痫状态下 MG 的活化及与 IL- 1 产生的关系， 本实验先分离纯化培养 新生大鼠大脑皮质 MG，再以 KA 激活 MG 或以美满霉素预处理抑制 MG 的活化，然 后应用免疫组织化学方法观察 MG 特异性标志物 OX- 42 的表达变化；采用 Elisa 法测 定 MG 条件培养液内 IL- 1 的含量；采用 RT- PCR 法检测 MG 内 IL- 1mRNA 的表达 变化。免疫组织化学结果显示，KA 作用 MG2h 后，MG 出现显著的胞体增大、突起 回缩的形态学改变，MG 内 OX- 42 的免疫反应较正常组和美满霉素+KA 组明显增强 （P 0.01） 。Elisa 检测结果显示，
6、MG 条件培养液中 IL- 1 的含量在 KA 组中明显高 于正常组（P 0.01） ；而美满霉素+KA 组 IL- 1 的含量则明显低于 KA 组（P 0.01） 。 RT- PCR 结果显示， MG 内 IL- 1 mRNA 的含量在 KA 组中明显高于正常组 （P 0.01） ； 而在美满霉素+KA 组则显著低于 KA 组（P 0.01） 。结果提示，KA 对 MG 有显著的 激活作用，激活的 MG 产生 IL- 1 显著增多。MG 抑制剂美满霉素能阻遏上述效应。 第二部分、活化的第二部分、活化的 MG 条件培养液对大鼠癫痫发作行为学和海马神经元电生理 特性的影响 条件培养液对大鼠癫痫发
7、作行为学和海马神经元电生理 特性的影响 我们在前面的实验已证实，KA 能显著激活 MG 并致其产生和分泌 IL- 1 增多。 推测活化的 MG 有可能通过过量产生的 IL- 1 而影响神经元的兴奋性进而参与癫痫的 发病。为了证实这一推测，本实验取三种培养液:即正常 MG 条件培养液（UT- MCM） 、 KA 激活的 MG 条件培养液（KA- MCM） 、用 IL- 1 抗体预处理的 KA- MCM（IL- 1 抗体KA- MCM） ，分别行大鼠侧脑室注射，观察大鼠行为学改变和脑电图的变化； 行大鼠海马 CA3 区注射，记录其诱发电位的改变；再取上述三组培养液孵育离体培 养的海马神经元，以全细
8、胞膜片钳技术检测其钙电流的变化。结果： （1）行为学观察： UT- MCM组大鼠无明显的痫性发作； KA- MCM组大鼠表现为癫痫发作级； IL- 1 抗体KA- MCM 组大鼠表现为癫痫发作级。（2）EEG 结果证实：UT- MCM 行侧脑室注射后大脑皮质 EEG 显示为平稳的基础波；KA- MCM 组有频发异常高电位 脑电波的出现；IL- 1 抗体KA- MCM 组痫性异常放电明显减弱，波幅及频率均较 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 3 KA- MCM 组低。（3）海马诱发电位显示：KA- MCM 组海马群峰电位（PS）的相对
9、 幅度与 UT- MCM 组比较显著升高，差异有显著性( P 0.01)；IL- 1 抗体KA- MCM 组 PS 的幅度较 KA- MCM 组显著下调( P 0.05)。（4）膜片钳结果显示：KA- MCM 组较 UT- MCM 组电流幅度和电流密度显著增高( P 0.01)，IL- 1 抗体KA- MCM 组 电流幅度和电流密度较 KA- MCM 组显著下降，但仍高于 UT- MCM 组( P 0.05)。以 上结果表明，活化的 MG 产生的生物活性物质能够导致癫痫的发生，其机制与增强神 经元的兴奋性，增加神经元钙内流有关。而 IL- 1 在这一过程中扮演重要的角色。 第三部分、 活化的第
10、三部分、 活化的 MG 条件培养液对大鼠海马神经元条件培养液对大鼠海马神经元 iNOS 和和 NMDAR1 表达的 影响 表达的 影响 文献表明，IL- 1 对神经元的促兴奋性效应可能不仅通过活化 NMDAR 和非 NMDAR，介导 Ca2+内流而产生快速作用，而且还可通过产生其他活性物质或激活有 关信号转导通路等多种途径进一步参与神经元兴奋毒性损伤过程。有研究资料提示 IL- 1 的异常增加产生的促痫效应可能与 iNOS、NMDAR 的表达增高有关。我们在第 二部分实验已经证实，KA 激活的小胶质细胞条件培养液能够促进电压依赖性钙通道 （VDCC）的开放，引起 Ca2+内流致神经元兴奋性增强
11、进而诱发癫痫的发生，那么活 化 MG 来源的 IL- 1 是否对神经元内 iNOS 和 NMDAR1 产生影响而参与癫痫的病理 过程呢？为了探明这个问题，本实验以三种不同的 MG 条件培养液即 UT- MCM、 KA- MCM、IL- 1 抗体KA- MCM 作为刺激因素，分别行大鼠侧脑室注射或孵育离体 培养的海马神经元，采用 Western Blot 或 RT- PCR 技术分别检测大鼠海马组织或培养 的海马神经元中 iNOS 和 NMDAR1 表达的变化。Western Blot 结果显示 KA- MCM 组 大鼠海马组织中 iNOS 和 NMDAR1 的蛋白表达水平较 UT- MCM 组
12、显著升高( P 0.01)，IL- 1 抗体KA- MCM 组较 KA- MCM 组明显减弱( P 0.01)，但仍然高于 UT- MCM 组( P 0.01)。RT- PCR 结果显示，与 UT- MCM 组相比，培养的海马神经元 中 iNOS 和NMDAR1 的 mRNA 表达在KA- MCM 组中显著升高( P 0.01)， 而用IL- 1 抗体预处理的 IL- 1 抗体KA- MCM 组较 KA- MCM 组则显著下降( P 0.01)。 离体海 马神经元与在体海马组织中 iNOS 和 NMDAR1 的表达变化基本一致。结果提示，KA 活化的 MG 条件培养液中 IL- 1 能显著上调
13、大鼠海马神经元 iNOS 和 NMDAR1 的表 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 4 达。 第四部分、活化的第四部分、活化的 MG 条件培养液对培养的海马神经元氨基酸类神经递质的影响条件培养液对培养的海马神经元氨基酸类神经递质的影响 氨基酸类神经递质学说在癫痫的发作与治疗中占有主导地位， 谷氨酸 （glutamate， Glu）和 - 氨基丁酸（aminobutyric acid，GABA）分别是脑内最主要的兴奋性和抑制 性神经递质，它们广泛地分布于各脑区，二者在功能上协调一致，共同维持着神经元 兴奋与抑制的平衡，在代谢上密切相关
14、，并可循环转换。我们在第二部分和第三部分 的实验中发现，活化 MG 来源的 IL- 1 参与了癫痫的发生，其机制与 Ca2+内流增加， NMDAR1 和 iNOS 表达升高有关，而这三者与 Glu 和 GABA 都有着功能或代谢上的 某些联系，提示通过 IL- 1 介导的活化的 MG 与神经元之间的相互作用也可能影响神 经元 Glu 和GABA的分泌和产生。 因此， 本实验用三种培养液:即UT- MCM、 KA- MCM、 IL- 1 受体拮抗剂（IL- 1ra）KA- MCM 分别孵育离体培养的海马神经元，再收集三组 神经元培养液， 采用高效液相色谱技术检测各组海马神经元 Glu 和 GAB
15、A 分泌量的变 化。实验发现，与 UT- MCM 组比较，KA- MCM 组 Glu 的分泌量显著增多( P 0.01)， GABA 分泌显著减少( P 0.01)，二者比例失衡。而用 IL- 1ra 预处理的 KA- MCM 作用 于海马神经元后，则显著减弱海马神经元中 Glu 的分泌( P 0.05)，增加 GABA 的分 泌( P 0.05)。结果表明，KA 活化的 MG 条件培养液促进 Glu 的分泌，减少 GABA 的分泌，使二者比例失调，而 IL- 1ra 对此效应有拮抗作用。 小小 结：结： 本研究表明，KA 对 MG 有显著的激活作用，激活的 MG 产生 IL- 1 显 著增多
16、。 用三种不同的 MG 条件培养液： 即 UT- MCM、 KA- MCM、 IL- 1 抗体或 IL- 1ra KA- MCM，行大鼠侧脑室注射或孵育培养的海马神经元，电生理研究证实：KA 活 化的 MG 条件培养液能够诱发癫痫的发生，产生痫性脑电波，使海马 CA3 区诱发电 位增强，并可明显增强电压依赖性的钙电流；分子生物学实验证实：KA 活化的 MG 条件培养液能上调 NMDAR1 和 iNOS 的表达； 生物化学实验证实， KA 活化的 MG 条 件培养液可促进神经元 Glu 分泌，减少 GABA 的分泌，使二者比例失调。而用 IL- 1 抗体或 IL- 1ra 预处理，可显著拮抗上述效应。综上所述，小胶质细胞与神经元之间在 癫痫病程中存在着相互作用，共同参与癫痫病理进程，而 IL- 1 可能是
