《fas基因靶向转导卵巢癌细胞系skov3的实验研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《fas基因靶向转导卵巢癌细胞系skov3的实验研究（71页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、中国协和医科大学 博士学位论文 Fas基因靶向转导卵巢癌细胞系SKOV的实验研究 姓名：丁西来 申请学位级别：博士 专业：妇产科学 指导教师：沈铿;何维 20040501 中国协和医科大学博士学位论文 A m p b p B S A e D N A D E P C D M S O D N a s e d N T P D T T E B E D T A F C S F I T C H T d R H R P m E R T I L I P T G k b k D L B B M E M H C M T T 英文缩略语 A m p i c i l l i n B a s ep a i r B o
2、v i n es e r u ma l b u m i n C o m p l e m e n t a r yD N A D i e t h y l p y r o c a r b o n a t e D i m e t h y l s u l f o x i d e D e o x y r i b o n u l c e a s e D e o x y n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e D i t h i o t h r e i t o l E t h i d i u mb r o m i d e E t h y l e n e d i a
3、 m i n et e t r a c e t i ca c i d F e t a lc a l fs e r u m F l u o r e s c e i ni s o t h i O c y a n a t e 3 H t h y m i d i n e H o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e h u m a nt e l o m e r a s er e v e r s e T r a n s c r i p t a s e I n t e r l e u k i n I s o p r o p y l t h i B D g a l a c
4、 t o s i d e K i l o b a s e K il o d a l t o n L u r i a B e r t a n im e d i u m B m e r c a p t o e t h a n o l M a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x 3 一( 4 ，5 - d i m e t h y l t h i a z o 卜2 一y 1 ) 2 ，5 一 d i p h e n y lt e t r a z o l i u mb r o m i d e N a t u r a lk i l l
5、 e r 1 氨苄青霉素 碱基对 牛血清白蛋白 互补脱氧核糖核酸 二乙基焦炭酸盐 二甲基亚砜 脱氧核糖核酸酶 脱氧核苷三磷酸 二硫苏糖醇 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 胎牛血清 异硫氰酸荧光素 3 H 一胸腺嘧啶 辣根过氧化物酶 人端粒酶逆转录酶 自细胞介索 异丙基硫代一6 一D 半乳糖苷 千碱基 千道尔顿 L B 培养基 B 一巯基乙醇 主要组织相容性复合体 二甲基偶氮唑蓝 自然杀伤( 细胞) 一一 ! 璺堡塑垦型查兰壁主兰堡垒苎 O D O p t i c a ld e n s i t y 光密度 O E C P A G E P B M C P B S P C R P E P E G h u m
6、 a no v a r i a ne p i t h e l i a lc a r c i n o m a 人卵巢上皮性癌 P o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 P e r i p h e r a lb l o o dm o n o n u c l e a rc e l l外周血单个核细胞 P h o s p h a t e b u f f e r e ds a li n e磷酸缓冲盐溶液 P o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链反应
7、 p h y e o e r y t h r i n 藻红蛋白 P o l y e t h y l e n eg l y c o l聚L - - - 醇 R T 。P C RR e v e r s et r a n s c r i p t i o n P o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n 反转录聚合酶链式反应 r p m R o u n dp e rm i n u t e 毽i 食 S D SS o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基磺酸钠 T C RTc e l l r e c e p t o r
8、T 细胞受体 T I L T u m o r i n f i l t r a t i n gl y m p h o c y t e s肿瘤浸润T 淋巴细胞 T r i s T r i s h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 2 中国协和医科大学博士学位论文 摘要 背景 卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤，目前对于晚期卵巢癌患者预后并无明显 改善，因而探索有效的治疗方法仍是解决问题的关键。诱导细胞凋亡是很有前途 的肿瘤治疗方法，研究发现在卵巢上皮癌细胞表面F a s 表达缺失或减少，经F a s 真核表达载体转染卵巢
9、癌细胞可提高F a s 基因表达，促进F a s 抗体诱导卵巢癌细 胞凋亡。虽然基因治疗在卵巢癌治疗中显示了广阔的前景，但目前仍然存在许多 问题。其中突出的问题就是转染基因表达缺乏靶向性和转染的效率和安全性问题。 目的 本研究旨在探讨低表达F a s 的卵巢上皮癌细胞转染F a s 基因后是否能增加免疫 效应细胞对其诱导凋亡的敏感性。为了解决基因转导中靶向性差的问题，在F a s 基因上游插入h T E R T 启动子，为了解决体内基因转导效率低安全性差的问题，构 建穿梭质粒p s N A V h T E R T - F a s ，用A A V 包装。 方法 第一部分以免疫组化方法了解F a
10、s 和F a s L 在卵巢上皮癌和正常卵巢上皮细胞 的表达。 第二部分构建质粒p A d r r - F 并转染S K O V 3 。将F a s 基因自质粒p c D N A 3 F a s 中 用K p nI 和X b aI 切出，插入到K p nI 和X b aI 双酶切后的载体p A d T e r t 中h T E R T 启动子的下游，构建p A d T F 。然后转染p A d T - F 到低表达F a s 的S K O V 3 ，并转染 p A d T 和P C D N A 3 F a s 作为对照，命名为T - F 、T 和F 。 第三部分分离外周血单个核细胞，用抗T C
11、 Ry8 单克隆抗体刺激活化，然后用 Y 6 T 细胞来杀伤S K O V 3 、T 、F 和T - F ，并用F a s L 封闭俩T 细胞后重复上述实验 作为对照。 第四部分通过P C R 从p A d T - F 中扩增T - F 片段，并在其两端加B s p l 4 0 7 I 和S n a B l 酶切位点，然后插入到B s p l 4 0 7 I 和S n a B I 酶切后的p s N A V 载体，构建质粒 p s N A V T F 。 中国协和医科大学博士学位论文 结果 第一部分：正常卵巢上皮F a s 表达阳性率8 5 7 ，F a s L 完全不表达；而卵巢上 皮癌F
12、a s 表达阳性率3 1 9 ，F a s L 表达阳性率8 5 。 第二部分：质粒p A d T - F 经酶切及测序鉴定构建成功。转染S K O V 3 鉴定结果如 下：R e a l - T i m eP C R 中T F 的C T 值为2 9 ，F 的c T 值为3 1 4 ，T 和S K O V 3 不表达 F a s ；W e s t e r nB l o t 结果显示在F 和T - F 组F a s 蛋白有表达，T - F 组表达明显强于 F 组；流式细胞分析F a s 在S K O V 3 、T 、F 、T F 组分别为1 1 、4 9 、1 0 9 、 1 5 1 ，F 、T
13、 F 组明显升高，其中T F 组较高。 第三部分：免疫荧光双染流式细胞分析Y 6T 细胞的比例为8 7 。M T T 未封闭 时随效靶比增加Y 6 T 细胞杀伤活性增加，而且转染F a s 组可提高杀伤活性，在T - F 组更明显；封闭后部分降低了Y 6T 细胞杀伤活性，而且随效靶比增加T 6T 细胞杀 伤活性增加不明显。 第四部分：穿梭质粒p s N A V T - F 经酶切及测序鉴定构建成功。 结论 1 ) F a s 在卵巢上皮癌细胞低表达，可能系肿瘤细胞逃避F a s 介导的宿主免疫 的机制。 2 ) 本研究成功构建质粒p A d T - F ，并转染S K O V 3 ，结果显示h
14、 T E R T 启动子 可提高F a s 表达，为进一步功能研究奠定了基础。 3 ) 本研究通过靶向转染F a s 基因提高其在卵巢上皮癌细胞表面表达，可促 进Y 6T 细胞对肿瘤的杀伤作用。 4 ) 本研究成功构建穿梭质粒p s N A V T - F ，用A A V 包装，为进一步动物实验奠 定了基础。 中国协和医科大学博士学位论文 I n t r o d u c t i o n A b s t r a c t O v a r i a nc a n c e ri St h em o s tc o m m o nc a u s eo fc a n c e rd e a t hf r o m
15、 g y n e c o l o g i ct u m o r s T h el o n g - t e r mp r o g n o s i sf o rw o m e n w i t ha d v a n c e d o v a r i a nc a n c e ri sp o o r , a n dd i s c o v e r yo fn e w e re f f e c t i v et h e r a p y r e g i m e n s i st h e k e y I n d u c i n ga p o p t o s i s i sa p r o m i s i n g
16、m e t h o do fc a n c e r t h e r a p y S o m er e s e a r c hs h o w t h a tf a se x p r e s s i o ni sl o wi no v a r i a n e p i t h e l i a l c a r c i n o m a ，a n dt r a n s f e c t i o no f f a sg e n ec a l ls i g n i f i c a n t l yu p r e g u l a t et h ef a s e x p r e s s i o n i no v a r i a n e p i t h e l i a lc a r c i n o m a ，a n da p o p t o s i s w e r e e a s i l y i n d u c e db yf a sm o n o c l o n a la n t i
