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1、1 沈阳佰创生物技术有限公司 样本的前期处理及HE染色 制作人:赵恒 日 期:2014-12-30 取材取材 注意事项 1、植物材料选择时须尽可能不损伤植物体或所需要的部分 动物材料取用时常对动物施以麻醉,常用的麻醉剂有氯 仿和乙醚,或将动物杀死后迅速取出所需要的组织 2、取材必须新鲜,这一点对于从事细胞生物学研究尤为重 要,应该尽可能割取生活着的组织块,并投入固定液 3、切取材料时刀要锐利,避免因挤压细胞使其受到损伤 4、切取的材料应该小而薄,便于固定剂迅速渗入内部。一 般厚度不超过2mm,大小不超过55mm2 2 固定液的性质和条件 1、能迅速渗入组织,使组织细胞形态在短期内不至于有 较大
2、变化 2、固定液有相当的渗透力,对组织各部分的渗透力相等 ,可使组织内外完全固定 3、使组织细胞不至于因固定而引起人为的改变 4、尽可能避免固定剂使组织膨胀或收缩 5、使组织达到一定硬度,获得较佳的折光率和对染料具 有较强的亲合力。 固定 固定剂种类 单纯固定剂 :10%甲醛、 4%多聚甲醛 、饱和的苦味酸溶 液 、冰醋酸 、锇酸 混合固定剂 :Bouin氏固定液 、Zenker液(PH2.3)、 Carnoy液 、改良Bouin氏固定液 固定的目的 1、防止组织溶解及腐败,以保持组织和细胞与正常生活 时的形态相似 2、使细胞内蛋白质、脂肪、糖、酶等各种成分转变为不 溶性物质,以保持它原有的结
3、构与生活时的相仿 3、组织细胞内的不同物质经固定后可以产生不同的折光 率,对染料也产生不同的亲和力,造成光学上的差异 ,使得在生活情况下原来看不清楚的结构变得清晰起 来,并使得细胞各部分容易着色,有利于区别不同的 组织成分 4、固定剂的硬化作用,增加组织硬度,便于制片 固定时应注意的事项 1、固定液及被固定的组织必须新鲜;固定液的用量一般为 组织体积的1020倍 2、固定时间视组织块的种类、性质、大小,固定液的种类 性质、渗透力的强弱,固定时的温度的高低,实验目的 等来决定 3、防止被固定的组织因固定剂的作用而发生变形 4、固定所用的固定液,以新配的为好,放置过久会失效 5、在固定期间摇动组织
4、或摇动容器有利于固定液的渗入, 对长期固定的标本,可经常更换固定液 6、固定时间太短,就会影响组织固定的效果时间太长,福 尔马林会产生一种酸,影响核的染色 脱水透明 标本经二甲苯透明后,折射率改变,透明度提高,使得染 上色的部位更清晰地显示出来。 步骤 流水冲洗4h 70乙醇2h 80 乙醇过夜 90 乙醇 2h无水乙醇1h 无水乙醇1h 二甲苯15min 二 甲苯15min 较常用的透明剂是二甲苯、甲苯、苯、氯仿等 1、二甲苯作用较快,透明力强,但组织块在其中停留过久, 容易收缩变脆变硬 2、甲苯的一般性质与二甲苯相似。用法亦同,唯沸点较低, 透明较慢,但不会使组织变脆 3、苯的用法同于二甲
5、苯,对组织的收缩作用小,但须警惕其 爆炸和吸入而引起中毒。 4、氯仿适于大块组织的透明 注意事项 1、透明时间应由组织大小而定,般各级停留时间在5min 至15min,在纯二甲苯中应更换2次,总时间则以不超过 1h为宜 2、材料经过透明,会显示出前一步脱水的效果如何,若脱 水彻底,组织则显现透明状态,如组织中有白色云雾状 说明脱水不净,须返工处理,但返工的效果往往不好 3、使用二甲苯透明时,应避免其挥发和吸收空气中的水分 并保持其无水状态 浸蜡包埋 1、组织经过脱水透明处理后浸蜡4h,然后进行包埋 2、浸蜡须在恒温箱中进行,恒温箱的温度调节至高于石 蜡熔点3度 切片可能产生的问题及解决方法 切
6、片厚薄不匀 原 因: 1、切片机有毛病 2、夹刀不当,刀的倾角太大 3、未旋紧标本台螺旋 4、石蜡块过硬 解决办 法 1矫正切片机装置 2对症治疗 3旋紧螺旋 4将石蜡块在水中浸泡 材料发生裂隙破碎或脱落 原 因: 1、脱水不干净 2、有透明剂残留 3、石蜡透入时,温度过高或时间过长 4、由于脱水剂和透明剂的影响,使组织变硬发脆 5、材料太硬或太粗 补 救 办 法 : 1、无法弥补 2、增加浸蜡时间,重新包埋 3、无法补救 4、用正丁醇、叔丁醇和二氧六环等进行脱水和透明 5、在蜡块表面涂一薄层火棉胶溶液 展片和捞片 1、直接展片法:在载玻片上滴加几滴蒸馏水,然后把切片 铺在小滴上面,用酒精灯在
7、载玻片下面加热,待完全展 平,倾斜载玻片,倒弃多余水分,同时摆正切片。 2、温水漂浮法:用恒温水浴箱,先使水温保持在42,使 切好的石蜡切片漂浮在温水中受热后及在表面张力的作 用会自然平整地展开,必要时可用眼科镊轻轻拔开,然 后捞片,并及时编号。 展好的切片放在64恒温烤箱中4h,烤干备用。 包埋模具 染色缸 切片盒 切片机 HE 苏木精 伊红染色法简称HE染色法 ,石蜡切片技术里 常用的染色法之一 。S苏木精染液为碱性 ,主要使细胞核内 的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色 ;伊红为酸性染料 , 主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色 。HE染色法是 组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使
8、用最广泛 的技术方法。 染色步骤 1、64烤片30min 2、脱蜡至水(二甲苯各15min,无水乙醇各5min ,90、80、70乙醇各1min) 3、蒸馏水浸洗3min 4、苏木素染3min 5、盐酸酒精分化 6、自来水返蓝15min 7、伊红染色30min 8、脱水(70、80、90乙醇各30s,无水乙醇各 2min,二甲苯各15min) 9、封片镜检 几种常见的染色问题 脱蜡: 切片中白色的区域脱蜡不彻底,染色液由 于石蜡斑点的残留而不能渗透着色。 原因:烤( 烘) 片温度 太低,脱蜡前没有充分烤( 烘) 干。 二甲苯脱蜡时 间不足, 或二甲苯使用过 久,造成脱蜡不尽。 对策:切片需退回
9、到脱 蜡步骤,延长脱蜡时间, 或跟换二甲苯,重新染色 。 染色: 苏木素着色 原因:染色时间短;苏木 素过度氧化,失去染色能 力;分化时间过长。 苏木素染色太浅,细胞核 与细胞质颜色对比度差。 对策:切片重新染色。 细胞核过染, 核膜、核仁等不清晰, 细胞质( 尤其是皮肤上皮细胞) 含有大量的 细胞核染色液苏木精, 导致细胞核与细胞 质比例失调。 原因:与图2相反,染色液 时间过长、切片太厚、分化 步骤时间太短。 对策:如果切片不是因为太 厚,脱色、漂白、重新染色, 对于染色和分化时间做些适当 的调整。若太厚则需要重新切 片。 切片细胞核棕色, 表明苏木精 没有充分蓝化, 或苏木精过度氧化 失
10、去染色能力 原因:苏木精染色液过度氧化 和切片在苏木精染液染色后返 蓝不足。 对策:染色前检查苏木精染色液 的染色能力,过渡氧化,应及时 更换。其次,在苏木精染色后, 给切片以足够的蓝化时间。 染色后有杂质 原因:苏木精染色液中的 金属膜,黏附在玻片上。 对策:每天染色前仔细过 滤苏木精染色液,或建议 使用半氧化苏木精染色液 。 伊红着色 切片中央区域伊红染色不均 匀, 可能为弱碱性溶液残留导致 伊红拒染所致 原因:伊红染液的pH 值可能大于5 ;也可能是蓝化液残留过多;切片 太薄;或切片经伊红染色后在乙醇 脱水时间过长。 对策:检查伊红染液的pH值,用 乙酸将其调节在4.6-5.0 之间,使
11、伊 红染色色彩艳丽。确保每次蓝化后 ,用自来水冲干净。检查切片的厚 度。脱水时不要让切片在低浓度乙 醇停留时间过长, 因为含水多的低 浓度乙醇会将伊红的颜色分化掉。 原因:伊红染色液浓度太高;切 片在伊红染色时间过长;切片在 伊红染色后经乙醇脱水步骤时过 的太快, 而使乙醇分化伊红的作 用不能产生。 对策:适当稀释伊红染色液,减 少伊红染色时间,或者使切片在 乙醇脱水等步骤时,停留时间相 对均匀。同样, 也要检查切片的 厚度是否合适。 伊红深染导致细胞核与细 胞质没有层次,缺乏对比 在显微镜下呈现大量水珠或 云雾状改变 原因:切片经梯度乙醇处理后没 有完全脱水, 导致二甲苯透明中 性树胶封固后
12、残留大量水分。也可 能是封片的时候出现的气泡。 对策:移去盖玻片, 用二甲苯溶 解封固剂如中性树胶。将切片置入 新鲜的无水乙醇换几道。待切片重 新脱水完全后,用新二甲苯透明, 中性树胶封固。所有用于脱水和透 明的液体,在使用一定时间以后, 应即时更换。将切片浸如二甲苯中 ,重新封片。 u封片: 盖玻片上有封固剂所致切片组织模糊不清 原因:盖玻片上可能有封固切 片的封固剂。 对策:移去盖玻片, 重新用干 净的盖玻片封片。 封片后镜下则会出现类似色素的 点状结晶或类似“裸核”样的改变 原因:切片封片前放置在 空气中时间太长, 以至于 二甲苯挥发切片干燥所致。 对策:移去组织切片上的 盖玻片和封固剂, 重新处 理。将切片水洗数分钟,然 后重新脱水、透明、封固。 封片过程中要保持组织切片 的轻度湿润,尽量不要让其 干燥。 原因:盖玻片弯曲或不平整 ;封固剂含二甲苯过多, 稀 释过度。 对策:移去盖玻片, 重新 找一张盖玻片,用干净的封 固剂封片。如用手工封片法 , 每天保证盛装封固剂的容 器, 在封固结束的时候盖紧 盖子。尽量使用小的容器盛 装封固剂,一旦封固剂太粘 稠,就可以废弃不再使用。