样本前期处理及HE染色-赵恒.

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1、1 沈阳佰创生物技术有限公司 样本的前期处理及HE染色 制作人：赵恒 日 期：2014-12-30 取材取材 注意事项 1、植物材料选择时须尽可能不损伤植物体或所需要的部分 动物材料取用时常对动物施以麻醉，常用的麻醉剂有氯 仿和乙醚，或将动物杀死后迅速取出所需要的组织 2、取材必须新鲜，这一点对于从事细胞生物学研究尤为重 要，应该尽可能割取生活着的组织块，并投入固定液 3、切取材料时刀要锐利，避免因挤压细胞使其受到损伤 4、切取的材料应该小而薄，便于固定剂迅速渗入内部。一 般厚度不超过2mm，大小不超过55mm2 2 固定液的性质和条件 1、能迅速渗入组织，使组织细胞形态在短期内不至于有 较大

2、变化 2、固定液有相当的渗透力，对组织各部分的渗透力相等 ，可使组织内外完全固定 3、使组织细胞不至于因固定而引起人为的改变 4、尽可能避免固定剂使组织膨胀或收缩 5、使组织达到一定硬度，获得较佳的折光率和对染料具 有较强的亲合力。 固定 固定剂种类 单纯固定剂 ：10%甲醛、 4%多聚甲醛 、饱和的苦味酸溶 液 、冰醋酸 、锇酸 混合固定剂 ：Bouin氏固定液 、Zenker液（PH2.3）、 Carnoy液 、改良Bouin氏固定液 固定的目的 1、防止组织溶解及腐败，以保持组织和细胞与正常生活 时的形态相似 2、使细胞内蛋白质、脂肪、糖、酶等各种成分转变为不 溶性物质，以保持它原有的结

3、构与生活时的相仿 3、组织细胞内的不同物质经固定后可以产生不同的折光 率，对染料也产生不同的亲和力，造成光学上的差异 ，使得在生活情况下原来看不清楚的结构变得清晰起 来，并使得细胞各部分容易着色，有利于区别不同的 组织成分 4、固定剂的硬化作用，增加组织硬度，便于制片 固定时应注意的事项 1、固定液及被固定的组织必须新鲜；固定液的用量一般为 组织体积的1020倍 2、固定时间视组织块的种类、性质、大小，固定液的种类 性质、渗透力的强弱，固定时的温度的高低，实验目的 等来决定 3、防止被固定的组织因固定剂的作用而发生变形 4、固定所用的固定液，以新配的为好，放置过久会失效 5、在固定期间摇动组织

4、或摇动容器有利于固定液的渗入， 对长期固定的标本，可经常更换固定液 6、固定时间太短，就会影响组织固定的效果时间太长，福 尔马林会产生一种酸，影响核的染色 脱水透明 标本经二甲苯透明后，折射率改变，透明度提高，使得染 上色的部位更清晰地显示出来。 步骤 流水冲洗4h 70乙醇2h 80 乙醇过夜 90 乙醇 2h无水乙醇1h 无水乙醇1h 二甲苯15min 二 甲苯15min 较常用的透明剂是二甲苯、甲苯、苯、氯仿等 1、二甲苯作用较快，透明力强，但组织块在其中停留过久， 容易收缩变脆变硬 2、甲苯的一般性质与二甲苯相似。用法亦同，唯沸点较低， 透明较慢，但不会使组织变脆 3、苯的用法同于二甲

5、苯，对组织的收缩作用小，但须警惕其 爆炸和吸入而引起中毒。 4、氯仿适于大块组织的透明 注意事项 1、透明时间应由组织大小而定，般各级停留时间在5min 至15min，在纯二甲苯中应更换2次，总时间则以不超过 1h为宜 2、材料经过透明，会显示出前一步脱水的效果如何，若脱 水彻底，组织则显现透明状态，如组织中有白色云雾状 说明脱水不净，须返工处理，但返工的效果往往不好 3、使用二甲苯透明时，应避免其挥发和吸收空气中的水分 并保持其无水状态 浸蜡包埋 1、组织经过脱水透明处理后浸蜡4h，然后进行包埋 2、浸蜡须在恒温箱中进行，恒温箱的温度调节至高于石 蜡熔点3度 切片可能产生的问题及解决方法 切

6、片厚薄不匀 原 因： 1、切片机有毛病 2、夹刀不当，刀的倾角太大 3、未旋紧标本台螺旋 4、石蜡块过硬 解决办 法 1矫正切片机装置 2对症治疗 3旋紧螺旋 4将石蜡块在水中浸泡 材料发生裂隙破碎或脱落 原 因： 1、脱水不干净 2、有透明剂残留 3、石蜡透入时，温度过高或时间过长 4、由于脱水剂和透明剂的影响，使组织变硬发脆 5、材料太硬或太粗 补 救 办 法 ： 1、无法弥补 2、增加浸蜡时间，重新包埋 3、无法补救 4、用正丁醇、叔丁醇和二氧六环等进行脱水和透明 5、在蜡块表面涂一薄层火棉胶溶液 展片和捞片 1、直接展片法：在载玻片上滴加几滴蒸馏水，然后把切片 铺在小滴上面，用酒精灯在

7、载玻片下面加热，待完全展 平，倾斜载玻片，倒弃多余水分，同时摆正切片。 2、温水漂浮法：用恒温水浴箱，先使水温保持在42，使 切好的石蜡切片漂浮在温水中受热后及在表面张力的作 用会自然平整地展开，必要时可用眼科镊轻轻拔开，然 后捞片，并及时编号。 展好的切片放在64恒温烤箱中4h，烤干备用。 包埋模具 染色缸 切片盒 切片机 HE 苏木精 伊红染色法简称HE染色法 ，石蜡切片技术里 常用的染色法之一 。S苏木精染液为碱性 ，主要使细胞核内 的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色 ；伊红为酸性染料 ， 主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色 。HE染色法是 组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使

8、用最广泛 的技术方法。 染色步骤 1、64烤片30min 2、脱蜡至水（二甲苯各15min，无水乙醇各5min ，90、80、70乙醇各1min） 3、蒸馏水浸洗3min 4、苏木素染3min 5、盐酸酒精分化 6、自来水返蓝15min 7、伊红染色30min 8、脱水（70、80、90乙醇各30s，无水乙醇各 2min，二甲苯各15min） 9、封片镜检 几种常见的染色问题 脱蜡： 切片中白色的区域脱蜡不彻底，染色液由 于石蜡斑点的残留而不能渗透着色。 原因：烤( 烘) 片温度 太低，脱蜡前没有充分烤( 烘) 干。 二甲苯脱蜡时 间不足， 或二甲苯使用过 久，造成脱蜡不尽。 对策：切片需退回

9、到脱 蜡步骤，延长脱蜡时间， 或跟换二甲苯，重新染色 。 染色： 苏木素着色 原因：染色时间短；苏木 素过度氧化，失去染色能 力；分化时间过长。 苏木素染色太浅，细胞核 与细胞质颜色对比度差。 对策：切片重新染色。 细胞核过染， 核膜、核仁等不清晰， 细胞质( 尤其是皮肤上皮细胞) 含有大量的 细胞核染色液苏木精， 导致细胞核与细胞 质比例失调。 原因：与图2相反，染色液 时间过长、切片太厚、分化 步骤时间太短。 对策：如果切片不是因为太 厚，脱色、漂白、重新染色， 对于染色和分化时间做些适当 的调整。若太厚则需要重新切 片。 切片细胞核棕色， 表明苏木精 没有充分蓝化， 或苏木精过度氧化 失

10、去染色能力 原因：苏木精染色液过度氧化 和切片在苏木精染液染色后返 蓝不足。 对策：染色前检查苏木精染色液 的染色能力，过渡氧化，应及时 更换。其次，在苏木精染色后， 给切片以足够的蓝化时间。 染色后有杂质 原因：苏木精染色液中的 金属膜，黏附在玻片上。 对策：每天染色前仔细过 滤苏木精染色液，或建议 使用半氧化苏木精染色液 。 伊红着色 切片中央区域伊红染色不均 匀， 可能为弱碱性溶液残留导致 伊红拒染所致 原因：伊红染液的pH 值可能大于5 ；也可能是蓝化液残留过多；切片 太薄；或切片经伊红染色后在乙醇 脱水时间过长。 对策：检查伊红染液的pH值，用 乙酸将其调节在4.6-5.0 之间，使

11、伊 红染色色彩艳丽。确保每次蓝化后 ，用自来水冲干净。检查切片的厚 度。脱水时不要让切片在低浓度乙 醇停留时间过长， 因为含水多的低 浓度乙醇会将伊红的颜色分化掉。 原因：伊红染色液浓度太高；切 片在伊红染色时间过长；切片在 伊红染色后经乙醇脱水步骤时过 的太快， 而使乙醇分化伊红的作 用不能产生。 对策：适当稀释伊红染色液，减 少伊红染色时间，或者使切片在 乙醇脱水等步骤时，停留时间相 对均匀。同样， 也要检查切片的 厚度是否合适。 伊红深染导致细胞核与细 胞质没有层次，缺乏对比 在显微镜下呈现大量水珠或 云雾状改变 原因：切片经梯度乙醇处理后没 有完全脱水， 导致二甲苯透明中 性树胶封固后

12、残留大量水分。也可 能是封片的时候出现的气泡。 对策：移去盖玻片， 用二甲苯溶 解封固剂如中性树胶。将切片置入 新鲜的无水乙醇换几道。待切片重 新脱水完全后，用新二甲苯透明， 中性树胶封固。所有用于脱水和透 明的液体，在使用一定时间以后， 应即时更换。将切片浸如二甲苯中 ，重新封片。 u封片： 盖玻片上有封固剂所致切片组织模糊不清 原因：盖玻片上可能有封固切 片的封固剂。 对策：移去盖玻片， 重新用干 净的盖玻片封片。 封片后镜下则会出现类似色素的 点状结晶或类似“裸核”样的改变 原因：切片封片前放置在 空气中时间太长， 以至于 二甲苯挥发切片干燥所致。 对策：移去组织切片上的 盖玻片和封固剂， 重新处 理。将切片水洗数分钟，然 后重新脱水、透明、封固。 封片过程中要保持组织切片 的轻度湿润，尽量不要让其 干燥。 原因：盖玻片弯曲或不平整 ；封固剂含二甲苯过多， 稀 释过度。 对策：移去盖玻片， 重新 找一张盖玻片，用干净的封 固剂封片。如用手工封片法 ， 每天保证盛装封固剂的容 器， 在封固结束的时候盖紧 盖子。尽量使用小的容器盛 装封固剂，一旦封固剂太粘 稠，就可以废弃不再使用。