《高氧暴露下新生大鼠肺组织及ⅱ型肺泡上皮细胞上皮钠通道的表达与功能研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《高氧暴露下新生大鼠肺组织及ⅱ型肺泡上皮细胞上皮钠通道的表达与功能研究（81页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同 工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名：埠日期：二喇 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究 生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保
2、 证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科 大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学 校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密 内容除外) ，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。 论文作者签名： 指导教师签名： 日 目录 一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要7 二、英文缩略语1 4 三、论文 论文一 前言”1 5 H I J 舌”l 材料与方法1 6 实验结果2 l 讨论”2 8 结论一2 9 论文二 苟r 言“3 0 日U 舌“j u 材料与方法3 1 实验结果3 4
3、 讨论4 2 结论4 3 论文三 前言4 4 刖看”q q 材料与方法4 5 实验结果4 8 讨论”5 2 结论5 4 四、本研究创新性的自我评价5 5 五、参考文献5 6 六、附录 综述6 0 在学期间科研成绩7 6 致谢7 7 个人简介7 8 中文论著摘要 高氧暴露下新生大鼠肺组织及型肺泡上皮细胞上皮 钠通道的表达与功能研究 刖吾 近年来，随着早产儿管理技术和治疗手段的发展，极低和超低出生体重儿的 存活率有了明显改善。但随之而来，因肺组织尚未发育成熟，加上吸入高浓度氧 气，机械通气，感染等因素影响，使得早产儿支气管肺发育不良( b r o n c h o p u l m o n a r y
4、 d y s p l a s i a , B P D ) 的发病率在逐年上升。由于目前缺乏有效的监控手段及治疗方法， 重患多于生后1 年内死亡，即使幸存者，儿童早期呼吸系统疾病的高患病率，以 及远期神经发育障碍也严重影响了患儿的生活质量。 研究表明炎症反应在B P D 发生、发展中发挥了重要作用。由于炎症反应增加 了肺泡毛细血管通透性，大量白蛋白和其它血清蛋白渗出，使得肺水肿成为B P D 早期的主要病理表现之一。 大量体内研究证实，阿米洛利( a m i l o r i d e ) 敏感性上皮钠通道( e p i t h e l i a ls o d i u m c h a n n e l
5、，E N a C ) 是钠离子从顶膜进入极化上皮细胞的主要通道，以对N a + 有高度 选择性和对亚微摩尔量的阿米洛利敏感为特征，在呼吸道上皮主要由三个同源亚 基a ，p 和丫组成，与肺内液体清除密切相关，而I I 型肺泡上皮( a l v e o l a re p i t h e l i a l t y p eI I ，A TI I ) 细胞是实现钠水重吸收的主要功能细胞。以往研究表明E N a C 功能 障碍不仅与多种病理情况下肺水肿的发生有关，而且决定了肺水肿的预后。然而， 有关B P D 早期E N a C 表达和功能的研究较少，且结论还不明确。 因此，本研究采用经典的高氧致新生大鼠B
6、 P D 模型，利用r e a l f i m e P C R 和 w e s t e r nb l o t 方法观察a ，D 和T - E N a C 亚基m R N A 和蛋白表达的动态变化，并同 时原代培养新生大鼠的A T I I 细胞，利用膜片钳技术和流式细胞技术，记录暴露高 氧中的A T I I 细胞阿米洛利敏感性钠电流和阿米洛利敏感性体积变化，以确定高氧 暴露下E N a C 表达变化与其功能的相关性。 方法 一、高氧暴露下新生大鼠肺组织E N a C 表达检测 l 、B P D 动物模型制备、分组与标本采集： 将自然分娩的新生W i s t a r 大鼠，随机分为高氧组和对照组，
7、每组3 2 只。高 氧组于生后1 2 小时内放入氧箱中，使箱内F i 侥= 0 8 5 ，C 0 2 o 5 ，湿度6 0 “ - - 7 0 ， 温度2 1 , - - , 2 5 0 C 。每天定时与对照组间交换母鼠。对照组以同样护理条件置于空气 中。每组分别于高氧暴露后1 、3 、5 和7 天随机选取8 只鼠，取肺待检。 2 、R e a l t i m eP C R 技术检测肺组织0 c 、p 一和7 - E N a Cm R N A 表达： 利用总R N A 提取试剂盒提取样本总R N A ，利用T I A N S c r i p tR TK i t 反转录合 成c D N A ，E
8、 x i c y c l 0 聊9 6 荧光定量仪和S Y B RG R E E N 进行荧光定量分析，利用 2 - A z x C T 法计算E N a Cm R N A 相对表达量。 3 、W e s t e r nb l o t 技术检测肺组织0 【、p 一和7 - E N a C 蛋白表达： 蛋白提取并定量，应用8 凝胶进行S D S P A G E 分离，将蛋白转至P V D F 膜， 用T B S 配置5 脱脂奶粉封闭P V D F 膜，一抗4 。C 过夜，二抗3 7 “ C 孵育1 小时。 应用E C L 试剂盒发光，分析图像。 二、高氧暴露下新生大鼠A T 细胞E N a C
9、表达检测 l 、新生大鼠A T I I 细胞的分离、纯化及鉴定： 出生2 4 小时内的W i s t a r 大鼠，无菌取肺，采用胰酶和胶原酶联合消化分离 细胞，应用差速贴壁和免疫粘附法纯化细胞，分别于2 1 0 2 和8 5 0 2 培养箱内进 行原代培养。应用S P C 免疫荧光染色及透射电镜进行细胞鉴定。分别于高氧暴露 后1 、2 和3 天收集细胞。 2 、R e a l t i m eP C R 技术检测A T I I 细胞中仅、p 和) , - E N a Cm R N A 表达： 方法同一、2 3 、W e s t e r nb l o t 技术检测A TI I 细胞中仅、p -
10、和，、- E N a C 蛋白表达： 2 方法同一、3 三、高氧暴露下新生大鼠A TI I 细胞E N a C 钠水转运功能检测 1 、新生大鼠A T I I 细胞的分离、纯化与培养： 同二、1 2 、膜片钳技术记录全细胞阿米洛利敏感性钠电流： 将长有A T I I 细胞的玻片从培养基中取出，浸入倒置相差显微镜的浴槽中。 应用M u l t i c l a m p7 0 0 B 膜片钳放大器进行系列阻抗和电容补偿。记录全细胞电流时 保持电位4 0m V ，应用1 2 0 至U + 8 0m V ，步阶2 0m V 的电位进行电流电压曲线分 析。滤波频率为1k H z ，采样频率为2k H z
11、。 3 、流式细胞技术检测阿米洛利敏感性细胞体积变化： 记录高氧组与对照组加入和未加入阿米洛利细胞的前向角散射光( F S C ) 的 峰值道数，并计算两者的差值。 四、统计分析 所有数据以均值士标准差表示。采用独立样本T 检验进行相同时间点组间比 较，采用单因素方差分析和L S D 法t 检验进行组内各时间点两两比较。以P O 0 5 作为差别有统计学意义的标准。 结果 一、高氧暴露下新生大鼠肺组织E N a C 表达 1 、肺组织中a E N a C 表达： a E N a Cm R N A 表达在高氧暴露1 天与对照组比较无显著差别，高氧暴露3 、 5 和7 天与对照组比较显著升高( 尸
12、 0 0 1 ) ，且随高氧时间延长表达量逐渐增加。 a E N a C 蛋白表达在高氧暴露1 、3 和7 天与对照组比较没有显著差别，而高 氧暴露5 天与对照组比较表达显著增加( 尸 0 0 5 ) 。高氧暴露5 天比高氧暴露3 天 表达量显著增加( P 0 0 1 ) 。 2 、肺组织中p - E N a C 表达： 3 p E N a Cm R N A 表达在高氧暴露1 、3 、5 和7 天均显著高于对照组( 尸 0 0 1 ) ， 且高氧l 、3 和5 天随高氧暴露时间延长表达量逐渐增加( P O 0 1 ) ，而高氧5 天 与高氧7 天比较无显著性差别。 3 - E N a C 蛋白
13、表达在各个时间点与对照组比较均显著增加( 1 和3 天P 0 0 5 ， 5 和7 天P 0 0 1 ) ，且高氧组和对照组均有随时间延长表达增加的趋势，生后5 天 和7 天显著高于生后l 天和3 天( 尸 O 0 1 ) 。 3 、肺组织中丫一E N a C 表达： 7 - E N a Cm R N A 表达在高氧暴露l 天和3 天显著高于对照组( 尸 O 0 1 ) ，且高 氧3 、5 和7 天随高氧暴露时间延长表达量逐渐减低，而高氧l 天和高氧3 天以及 高氧5 天和7 天比较无显著差别。 T - E N a C 蛋白表达在高氧暴露1 天与对照组比较显著增加( P O 0 1 ) ，而3 、5 和7 天与对照组的差别没有统计学显著性。高氧3 天蛋白表达显著低于高氧l 天 ( 氏0 0 1 ) 。 二、高氧暴露下新生大鼠A T 细胞E N a C 表达 l 、A TI I 细胞鉴定结果： 形态学特征：立方形或多角形，聚集生长呈铺路石样，胞浆内可见分泌颗粒。 S P C 免疫荧光鉴定：A T I I 细胞胞浆内可见绿色荧
