双水相萃取概要

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1、双水相萃取 很多生物产品无法使用有机溶剂萃取的方法进行分离纯 化。 蛋白质一般亲水性强，不溶于有机溶剂； 蛋白质在有机溶剂相中易变形失活。 (溶剂萃取法新技术之一） （ATPE:Two-aqueous phase extraction) 双水相萃取双水相萃取 萃取 液液萃取 液固萃取或浸提 超临界萃取 反胶团萃取 液膜萃取 双水相萃取 有机溶剂萃取 内容提纲： 1.双水相体系 2.双水相萃取的基本原理 3.影响双水相分配的主要因素 4.双水相萃取技术的发展 5.双水相萃取操作及应用 1.双水相体系 （1）双水相系统：一定浓度的两种水溶性高聚物或一 种高聚物与盐类在水中能形成两层互不相溶的匀相水

2、溶液 ，这样的水相系统称为双水相系统。 5%PEG6000 上层组成：2%Dextran500 93%水 3%PEG6000 下层组成：7%Dextran500 90%水 （2）双水相体系形成的原因： 聚合物的不相溶性（空间位阻） 聚合物的不相溶性：各个聚合物分子，都倾向于在其 周围有形状、大小和极性相同的分子，同时，由于不同 类型分子间的斥力大于同它们的亲水性有关的相互吸引 力，因此聚合物发生分离，形成两个不同的相。 对于某些聚合物溶液与一些无机盐溶液相混时，只要 浓度达到一定范围时，体系形成双水相的机理尚不清 楚。 聚合物溶液的混合 混合过程熵的增加：两种物质混合时，熵的增加与涉 及的分子

3、数目有关。 分子间相互作用力(能)：主要表现为分子中各个集团 间的相互作用力，随着分子量的增加，分子间各个集团数 目相应增加，其相互作用力也增大。 当分子间相互作用力与熵的增加相比占主导地位时， 就会分层。 一般认为，只要两聚合物水溶液的憎水程度有所差异， 混合时就会发生相分离。 （3）双水相体系的相图： 双节线；A-体系总组成；B、C-节点；B(A)C-系线;系线 的长度；K-临界点； 在同一系线上的不同点，总组成不同，而上下两相组成相 同，只是体积VT、VB不同，但它们均服从杠杆原理。 （4）双水相体系的种类： 高聚物-高聚物双水相(如PEG-Dextran)：易于与后 续处理连接，如直接

4、上离子交换柱而不必脱盐。 高聚物-盐双水相(如PEG- / ):盐浓度高，蛋 白质易盐析，废水处理困难。 非离子表面活性剂水胶团双相体系(如Triton-114表 面活性剂)：相成分简单，易于回收，应用还不多。 阴阳离子表面活性剂双水相体系（如SDS-CATB） 醇-盐双水相体系(如乙醇/丙醇-无机盐-水) 常见的双水相系统 聚合物-聚合物-水聚合物电解质-聚合物-水聚合物电解质-聚 合物电解质-水 聚合物-盐-水 聚丙烯乙二醇-甲 氧基聚乙二醇 硫酸葡萄糖钠盐-聚丙烯乙 二醇 硫酸葡萄糖钠盐- 羧甲基纤维素钠盐 聚丙烯乙二醇- 磷酸钾 聚乙二醇-聚乙烯 醇 羧甲基纤维素钠盐-甲基纤 维素 甲

5、氧基聚乙二醇 -磷酸钾 聚乙二醇-葡萄糖聚乙二醇-磷酸 钾 聚吡咯烷酮-甲基 纤维素 聚丙烯乙二醇- 葡萄糖 （5）双水相体系萃取的特点： 易于工业放大； 纯化倍数高(2-20倍)，目标产物有较高的收率(80%) ； 易于实现连续化操作，设备简单； 不易引起生物活性物质失活(含水量高达75%-90%)； 操作条件温和（常温常压）； 不存在有机溶剂残留问题，而且操作环境对人体无害 （高聚物一般为不挥发性物质）； 成本较高（聚合物价格昂贵，难以回收）。 2.双水相萃取的基本原理 双水相萃取法：不同的高分子溶液相互混合可产生两相 或多相系统，利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的 差异来进行萃取的方

6、法。 基本原理：物质在两相间的选择性分配。（双水相系统萃 取属于液-液萃取范畴） m:总分配系数，CT、CB分别为上相和下相中溶质的浓度。 大量研究表明：生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统 间的各种相互作用，主要有静电作用、疏水作用和亲和作用等 ，其分配系数可为各种相互作用之和。 静电作用：两相系统中若有带电溶质存在，会对大分子在两 相间的分配系数产生影响。（图5-15） Donnan Potential:当大分子或粒子带有静电荷时，在带有电荷 分配不相等时，就会在两相间产生电位差，称为道南电位。 疏水作用：某些大分子物质表面具有疏水区，溶质的表面疏 水性会对其在两相间的分配系数产生影响

7、。 3.影响双水相分配的主要因素 高聚物的相对分子质量 高聚物的浓度 盐的种类和浓度 PH值 温度 （1）高聚物的相对分子质量： 在高聚物浓度保持不变的前提下，降低该高聚物的相对分子质 量，被分配的可溶性生物大分子如蛋白质或核酸，或颗粒如细 胞或细胞碎片和细胞器，将更多地分配于该相。 以PEG-Dextran体系为例，DextranK PEGK（表5-4） 这种影响与蛋白质相对分子质量也存在关系，相对分子质量越 大，影响也随之增大。 （2）高聚物的浓度： 成相物质的总浓度越高，蛋白质越容易分配于其中的某一相； 而对于细胞等颗粒来说，在临界点附近细胞大多分配于其中的 某一相。 （3）盐的种类和浓

8、度： 盐的种类和浓度对分配系数的影响，主要反映在相间电位和 蛋白质的疏水性差异上，这是由于当双水相系统中存在这些 电解质时，达到平衡时，各项均需保持电中性的原则。 （4）PH的影响： 双水相系统的PH值能影响蛋白质上可解离集团的离解度，使 蛋白质表面电荷改变，影响其分配系数；另外，PH值也会影 响盐的解离（ ）。 （5）操作温度： 温度影响双水相系统的相图，继而影响蛋白质的分配系数， 在临界点附近尤为显著。 一般采用室温操作： 成相系统聚合物PEG对蛋白质有稳定作用，常温下蛋 白质不会发生变性； 常温下溶液粘度较低， 容易相分离； 常温操作节省冷却费用。 4.双水相萃取技术的发展 （1）历史：

9、 早在1896年，Beijerinck发现，当明胶与琼脂或明胶与 可溶性淀粉溶液相混时，得到一个混浊不透明的溶液，随 之分为两相，上相富含明胶，下相富含琼脂（或淀粉）， 这种现象被称为聚合物的不相溶性（incompatibility） ； 20世纪60年代，瑞典Lund大学的Albertsson P A及同事 最先提出了双水相萃取技术； 1979年，西德的Kula M R等人首次将ATPE应用于生物产 品分离； 20世纪80年代以来，越来越多的双水相系统被发现。 国内自20世纪80年代起也开展了ATPE技术研究。 （2）发展方向 廉价双水相体系的开发； 新的双水相体系探索； 可循环使用的双水相

10、成相聚合物：双水相体系发展中 的关键问题。 5.双水相萃取操作及应用： （1）双水相系统的选择： 双水相的形成-溶质的分配-相分离 配制高浓度高聚物和盐的备用溶液，利用其配制一系 列不同浓度、pH值及离子强度的双水相； 加入料液，加水调整，混合分配； 离心，分相； 分别取出上、下相，测定产物浓度和活性，计算分配 系数； 分析目标产物的收率和纯化倍数，确定最佳双水相系 统。 （2）双水相萃取技术的工艺流程主要由三部分 构成:目的产物的萃取;PEG的循环;无机盐的循 环。 目的产物的萃取：原料匀浆液与 PEG和无机盐在萃取器 中混合，然后进入分离器分相。通过选择合适的双水相 组成，一般使目标蛋白质

11、分配到上相（PEG相），而细胞 碎片、核酸、多糖和杂蛋白等分配到下相（富盐相）。 第二步萃取是将目标蛋白质转入富盐相，方法是在上相 中加入盐，形成新的双水相体系，从而将蛋白质与 PEG 分离，以利于使用超滤或透析将 PEG 回收利用和目的产 物进一步加工处理。 PEG的循环：在大规模 ATPE 过程中，成相材料的回 收和循环使用，不仅可以减少废水处理的费用，还可以 节约化学试剂，降低成本。PEG的回收有两种方法：A) 加入盐使目标蛋白质转入富盐相来回收 PEG；B)将 PEG 相通过离子交换树脂，用洗脱剂先洗去 PEG，再洗出蛋 白质。 无机盐的循环：将含无机盐相冷却，结晶，然后用离 心机分离收集。除此之外还可用电渗析法、膜分离法回 收盐类或除去 PEG相的盐。 （3）双水相萃取在药物分离中的应用 细胞匀浆液中 蛋白质的纯化 人生长激素的提取 中草药有效成分的提取 回顾与总结： 双 水 相 萃 取 1.双水相体系（定义义、形成原因、相图图、分类类、特点 ） 2.3.双水相萃取的基本原理（分配系数及其影响因素 ） 4.双水相萃取技术的发展（历史、发展方向） 5.双水相萃取操作及应用（选择选择 、工艺艺流程、应应用范 围围） 液-液萃取 谢谢！谢谢！谢谢！