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1、浙江大学 博士学位论文 成骨细胞、生长因子复合生物活性支架的骨再造研究 姓名：朱慧勇 申请学位级别：博士 专业：肿瘤学（口腔肿瘤） 指导教师：吴求亮 2003.4.1 浙江大学博士学位论文 缩略词对照 苏木素伊红染色 磷酸缓冲液 碱性磷酸酶 重组人骨形成蛋白2 噻唑蓝 二甲基亚砜 聚乳酸 聚乙醇酸 聚乳酸聚乙醇酸共聚物 聚乙二醇 骨形成蛋白 扫描电镜 精氨酸甘氨酸天冬氨酸 2 s P 蹦 T A A G P M D 胍 阴 札 n 舯 蹦 儿 阢 儿 阻 蹦 ；j 陋 成骨细胞、生长因子复合生物活性支架的骨再造研究 专业：肿瘤学( 口腔肿瘤) 博士研究生：朱慧勇 导师：吴求亮教授 中文摘要 颌
2、骨缺损是口腔颌面外科的常见问题可由炎症、外伤、肿瘤等原因造成，其 中肿瘤性的颌骨缺损在临床上更为多见，口腔恶性肿瘤手术往往导致下颌骨或上颌 骨的缺损，如何进行功能性的骨缺损修复( 包括颌骨缺损修复) 成为临床上一个重 要的研究课题，也为肿瘤外科术后修复重建的重要问题之一。目前l 临床上使用的修 复方法虽很多，但仍有一定的缺点，组织工程学是一门新兴学科。主要致力于组织 和器官的形成再生，其最大优点是所形成的组织具有功能和活力，具有与机体相同 的组织结构，因此采用组织工程技术进行颌骨缺损的修复，具有十分深远的临床应 用价值。 组织工程内容包括三个基本的要素，即种子细胞、细胞生长和分化的调节因子 和
3、细胞外基质材料( 生物可降解支架材料) 。骨组织工程种子细胞即成骨细胞目前 多由骨髓来源，骨髓基质细胞能在体外培养诱导分化为成骨细胞，但存在传代后细 胞老化、功能减弱等问题，因此需要采用生物活性因子来调节其生长和分化，目前 较为公认的是骨形成蛋白一2 ，而随着基因工程产品的出现，其应用也日趋广泛。支 架材料的选择也十分重要，材料与细胞必须有良好的亲和性及粘附性成骨细胞才能 在材料表面、生长增殖和分化，采用不同的生物可降解支架材料的复合应用于口腔 肿瘤术后骨缺损的组织工程修复尚未见报道。生长因子的载体目前报道较多，人工 合成的生物可降解支架作为生长因子的缓释载体应用于骨组织工程，并进行释放和 活
4、性的系统评价目前国内尚未见报道。因此本研究重点研制一种复合的新型生物可 降解支架，它不仅具有生物活性即与细胞有良好的亲和性及粘附性，而且含生长因 子缓释系统。把原代培养的成骨细胞在生物活性支架上混合培养后植入自体动物内 来观察其体内成骨的情况，进而评价采用组织工程技术构建特定形态骨组织的可行 性，为今后进行各种原因导致的骨组织缺损的修复具有十分重要的临床意义。 2 浙江大学博士学位论文 本课题分四个方面进行研究 第一部分成骨细胞的原代培养及生物学特性研究 为了建立一种骨髓基质细胞向成骨细胞转化的体外培养方法和骨组织工程种 子细胞的动物模型，本研究以家兔和正常人骨髓为实验对象，分别抽取骨髓约3
5、m l ， 利用密度梯度离心培养法和全骨髓培养法进行成骨细胞的原代培养，加入诱导分化 剂5 0ug m l 维生素C 、l O m m o l LB 甘油磷酸钠、1 0 。m o l L 地塞米松，再进行传代 培养。培养的成骨细胞进行生物学特性鉴定，包括相差显微镜观察细胞的形态及矿 化小结、H E 切片染色观察细胞的形态、改良G o m o n r i 钙一钻法进行碱性磷酸酶染色、 Y o nK o s s a 染色观察钙结节形成、扫描电镜观察细胞的形态、流式细胞仪检测细胞 周期及D N A 分析、流式细胞仪分析造血系标志C D 8 0 、C D 3 8 、C D 3 4 、C D 4 5 和
6、非造血 系标志C D 2 9 、C D 4 4 的细胞阳性率，从以上七个方面来验证成骨细胞的形态、分化 功能及细胞免疫学特性。 结果显示，骨髓基质细胞2 4 - 4 8 小时后即可贴壁，在诱导剂作用下可进行分化， 细胞呈多种形态有三角形、星形、多角形及长梭形等，并形成多种胞浆突起，细 胞呈集落生长趋势。至二周左右，细胞融合成单层，形态多转为梭形；细胞培养一 月后，在集落中央可见钙化点。H E 染色光镜观察细胞形态为长梭形、三角形、多角 形，有多个树状突起，细胞呈集落样生长。碱性磷酸酶染色阳性显示为棕色或黑色 颗粒。钙结节染色阳性钙化点处可见棕褐色沉着物。扫描电镜观察细胞呈多种形态， 有多个突起
7、，细胞突起相互连接，符合成骨细胞形态。原代培养的第3 代成骨细胞 细胞周期及D N A 分析：G o + G t 的比例为8 8 4 ，G 2 + S 的比例为1 1 6 ，3 T 3 细胞株细 胞周期及D N A 分析：G o + G t 的比例为7 9 7 ，G 。+ S 的比例为2 0 3 。人原代成骨细胞 C D 分子测定的细胞阳性率C D 2 9 、C D 4 4 、C D S O 、C D 3 8 、C D 3 4 、C D 4 5 分别为5 9 0 0 、 7 1 5 2 、2 2 7 、5 8 6 、2 2 0 8 、7 1 4 5 。 以上结果表明骨髓中的骨髓基质细胞可作为在
8、骨组织工程中获取成骨细胞的 来源，骨髓基质细胞经诱导分化后可转化为成骨细胞，经过生物学特性鉴定为成骨 细胞。培养的成骨细胞具有高分化潜能，可用作组织工程骨再造中的种子细胞来源。 3 成骨细胞、生长因子复台生物活性支架的骨再造研究 第二部分重组人骨形成蛋白一2 对兔骨髓基质细胞增殖分化作用 的研究 骨形成蛋白与成骨细胞的增殖和分化密切相关，而且应用于骨组织工程有望提 高其成功率。为了探讨基因重组人骨形成蛋白对成骨细胞来源的骨髓基质细胞的影 响，研究了不同浓度的r h B l 4 P 一2 ( 2 5 、5 0 、l O O 、2 0 0 、4 0 0 、5 0 0 n g m 1 ) 对骨髓基质
9、 细胞增殖和分化的影响。采用M T T 法研究不同浓度的r h B M P 一2 对骨髓基质细胞增殖 的影响，并与空白对照组相比较，结果显示小于5 0 0 n g m l 实验组的0 D 值与对照组 均有显著性差异( P 0 0 5 或 O 0 5 ) 。采用碱性磷酸酶活性检测试剂盒研究不同浓度的r h B M P 一2 对骨髓基 质细胞碱性磷酸酶活性的影响，并与空白对照组比较，结果显示不同浓度的实验组 与对照组的0 D 值均有显著性差异( P 0 0 5 ) ，菇且随着作用浓度的升高其o D 值 也逐渐增高。采用考马斯亮蓝染色研究不同浓度的r h B M P 一2 对骨髓基质细胞总蛋白 含量
10、的影响并与空白对照组比较，结果显示不同浓度的实验组与对照组的O D 值 均有显著性差异( P O 0 1 ) ，并且随着作用浓度的升高，其o D 值也逐渐增高。 以上结果表明r h B M P - 2 在低浓度时，即可显著增强骨髓基质细胞的增殖能力， 且在一定浓度范围内呈剂量一效应依赖关系，当浓度增加至l O O n g m l 时作用最强。 当增至5 0 0 n g m l 时，即无明显促增殖作用。r h B M P - 2 在较低浓度时，即可增加骨髓 基质细胞的A L P 活性及总蛋白的含量，其作用呈剂量一效应依赖关系，具有明显的促 骨髓基质细胞分化的作用。 第三部分r h B M P -
11、 2 缓释支架和新型复合支架材料的研制及评价 组织工程中支架材料的选择十分重要支架材料不仅要有利于成骨细胞的粘 附、增殖和分化，而且又必须是生长因子的良好缓释载体，也即要求具有生物活性。 本研究先进行聚乳酸和聚乙醇酸共聚物的合成及支架的制作，再在此基础上制作涂 敷I 型胶原的P L G A 复合支架的制作，采用乳液冷冻干燥法制作舍r h B l P 一2 缓释系 统的P L G A 支架，支架进行扫描电镜观察形态，检测其孔径及孔隙率。建立蛋白质 从支架材料中释放模型，分别在1 天至3 0 天之间的不同时间点提取其浸出液，采 4 渐江大学博士学位论文 用高效液相色谱分析仪建立标准浓度的色谱图，分
12、别检测不同时间点释放液中 r h B M P 一2 的色谱图，从而推算r h B M P 一2 的浓度，建立不同时间点累积r h B M P 一2 的释 放量( ) 与时间( 天) 的曲线。以r h B M P 2 异位骨形成试验模型为基础，在s D 大 鼠大腿股部肌袋内各植入P L G A 支架及含r h B N I P 一2 缓释的P L G A 支架一块，大小约l O m m X 6 m m ，作自身双侧对照，术后2 周、4 周、6 周取材、组织形态学观察以评价包埋 在P L G A 中r h B N P 一2 的活性。 结果显示P L G A 的数均分子量为8 1 5 7 1 2 ，多
13、分散系数为1 5 6 。支架材料的形态 观察显示表面呈多孔状，孔径约1 0 0 3 0 0um ，孔隙率约9 0 。包埋5 0 0ug r h B M P 一2 的支架材料的释放结果显示1 、3 、5 、7 、1 0 、1 5 、2 0 、2 5 、3 0 天，其累积释放量 依次为1 5 0 2 0 、2 2 4 1 7 、2 7 4 8 6 、3 0 9 0 2 、3 3 7 7 1 、3 5 8 4 5 、3 7 7 1 0 、3 9 1 2 3 、4 0 3 3 5 ug ，所占总量的百分比依次为3 0 0 、4 4 8 、5 4 9 、6 1 8 、6 7 5 、7 1 6 、7 5
14、4 、7 8 2 、 8 0 6 。r h B M P - 2 活性评价结果显示实验组在植入后2 周，可见在肌膜下有新生骨样 组织形成，材料部分降解吸收，在郝分新生骨区域，可见未分化间充质细胞正演变 成骨母细胞；植入后4 周，实验组肌膜下骨组织渐趋分化成熟，呈编织骨样新骨 周围可见排列成行的骨母细胞；植入后6 周，实验组可见新生骨更趋成熟，有板层 样骨形成，并逐渐形成骨髓腔。新生骨进一步占据材料降解吸收的空间：所有对照 组均未见骨组织形成，可见材料降解，逐渐被纤维组织所替代。 以上结果表明，应用该种材料及制作方法。从形态和结构上已满足骨组织工程 支架材料的要求；含B M P 缓释的支架释放在1
15、 天即可表现为爆发性释放，以后释放 速率逐渐减慢，至1 个月约达到8 0 9 6 ：释放的r h B M P 一2 仍保持了良好的诱骨活性和 成骨活性。 第四部分成骨细胞、生长因子与支架材料的体外混合培养 及体内成骨试验 在上述三部分实验的基础上，为了通过成骨细胞、生长因子与生物新型支架材 料的复合来构建组织工程化的骨组织，从而为临床上进行修复因肿瘤导致的顾骨缺 损打下基础。本实验采用的是兔原代培养的成骨细胞、使用的支架材料包括P L G A 、 P L G A 和I 型胶原复合物以及含r h B M P 一2 的生物活性支架，支架材料使用前进行消毒 和预湿。采用沉淀接种法把成骨细胞接种在支架
16、材料上混合培养，分别在培养5 天 成骨细胞、生长因子复台生物活性支架的骨再造研究 和1 0 天进行扫描电镜观察细胞在材料表面的生长、粘附等情况；部分细胞一支架培 养混合体植入自体兔内，与空白P L G A 支架作为对照，术后1 月、4 月取标本进行组 织学及扫描电镜观察。 体外混合培养结果显示在培养5 天，I 型胶原一P L G A 复合组和r h B M P 一2 缓释支 架组即可见大量成骨细胞粘附于支架材料表面，但有些细胞尚未形成突起：至培养 1 0 天，I 型胶原一P L G A 复合组和B M P 缓释支架组可见成骨细胞呈梭形、多角形或不 规则形，并形成多个胞体突起，牢固地粘附于支架材料表面，而单纯P L G A 组则细 胞数量较前者为少。体内植入结果显示，植入后1 月，成骨细胞一支架材料复合组 和成骨细胞一r h B M P 2 一支架材料复合组均可见有新生骨组织形成，材料部分降解，但 后者在新骨
