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1、厌氧菌的分离与鉴定 卫生部北京医院 陈东科 w 厌氧菌检验是临床微生物检验的重要组 成部分。在无氧（或少氧）条件下，或氧化 还原电势低的条件下才能繁殖的细菌称为厌 氧菌。因为厌氧菌在人体肠道、口腔、泌尿 生殖道正常菌群中占优势，所以当人体菌群 失调时，厌氧菌可能侵犯人体许多部位，发 生严重的甚至致死的内源性厌氧菌感染。厌 氧菌感染常发生在深部伤口, 但也可伴兼性厌 氧菌和需氧菌侵犯人体任何器官和组织。所 以，对厌氧菌检验应给予高度重视。 人体各部位厌氧菌寄生量及其与需氧菌之比 w_ w厌氧菌数量 眼结膜 鼻涕 唾液 牙表面 牙周袋与牙垢 _ w（cfug） 1034 1014 1089 109
2、10 101112 w厌氧菌与 需氧菌之比 10:1 10:1 810:1 1:1 1000:1 _ w厌氧菌数量 胃液 结肠 小肠 阴道 外尿道 皮肤 _ w （cfug） 1025 101112 1046 1089 1035 1034 厌氧菌与 需氧菌之比 1:1 1000:1 1:1 10:1 10:1 10:1 w_ 1.正确地选择标本 w 下列细菌学指征有助于选择标本做厌氧培养 ： （1）深部伤口或软组织脓肿的脓，特别是伴 有恶臭或含有硫磺颗粒时。 （2）可疑为气性坏疽或少见的严重产气或坏 死性感染所取得的坏死组织或病灶清除材料 。 （3）粘膜部位的感染灶取得的材料。 （4）从脑、肺
3、、肝或其他器官的脓肿或从腹 腔内、肛周、隔下或其他部位的脓肿取得的 材料。 w （5）无菌区感染灶的吸出液(包括血液 、脑脊液、腹水、胸水、滑膜液、羊水 等)。 （6）人或动物咬伤感染灶取得的材料 。 （7）变黑的或置于紫外线发红色荧光 的渗出物。 （8）革兰染色，镜下见到具有厌氧菌 独特形态的材料。 （9）可疑引起肉毒杆菌食物中毒的食 物。 2.正确地收集标本 w 厌氧菌是人体许多部位（如皮 肤、口咽部、肠道和泌尿生殖道） 正常菌群中的一部分，因此下列材 料无需做厌氧培养： （1）咽、鼻、尿道或直肠拭子。 （2）咳出的痰，通过支气管镜取的分 泌物，排出或导出的尿、粪及胃内容物 。 w 为排除
4、或尽量减少正常菌群中厌氧 菌的污染，用注射器抽取标本比用拭子 更好，特别适用于下列临床情况： （1）从未开放的脓肿抽取脓液。 （2）通过胸腔穿刺抽出的胸腔液。 （3）从耻骨联合上方做膀胱穿刺吸出或从肾 造口管收集的尿。 （4）气管切开吸取的肺分泌物。 w （5）穿刺抽出的腹腔液。 （6）通过腰椎穿刺抽出的脑脊液。 （7）窦道标本可插入小导管用注射器 吸出，注射器和针头内的气体应全部排 出，将其内容物直接注入一个已排出气 的无菌试管内。也可自窦道损伤部位取 材做活组织检查。如果必须使用拭子， 应尽快接种于适宜的培养基中。 3. 正确地运送标本 w 临床标本一旦离开人体部位，在进 入厌氧环境前，必
5、须防止大气中氧的毒 性作用。应及时将取材的拭子、塑料导 管内的少量液体、吸入注射器的标本装 入厌氧生物袋或管，在运送过程中要保 持厌氧状态。培养基内不应含有肝素， 因它会抑制细菌生长。 4. 使用新配制的培养基 w 初代接种厌氧菌最好使用新配制的 培养基。 平板培养基无需在厌氧条件下 贮存，用前可进行预还原，但厌氧条件 下贮存可延长培养基的有效期。 5. 提供可靠的厌氧环境 w 使用厌氧罐法、厌氧袋法或厌氧箱 法。在厌氧培养中必须使用氧化还原指 示剂，一般采用亚甲基美兰或刃天青， 每次要新鲜配制。如果能在孵育的整个 过程中维持厌氧条件，指示剂溶液将无 色，否则指示剂则变色。 6. 标本接种与孵
6、育 （1）拭子和液体标本直接接种固体和液体培养基（需 氧和厌氧培养各一份），在厌氧平板上贴一片灭滴灵 纸片（5g/片），置35培养。同时做直接涂片革兰 染色镜检。用铂-铱合金环（不用镍-铬合金环，因为 它可氧化接种物）三区划线接种平板，以保证长出单 个菌落。 w （2）若被检标本是组织块，则立刻将其移入无菌的 组织研磨器内，用硫乙醇酸盐混合研碎，最好在厌氧 箱内或无氧条件下操作。组织匀浆接种同液体标本。 w （3）可疑含有芽胞梭菌的标本，还要用乙醇或加热 处理后再行接种。 7. 直接涂片检查 w 当有足够的标本或收到两个拭子时，最 好在接种前做涂片革兰染色镜检，检查结果 可提示需要接种哪些培养
7、基（非常规使用的 ）。涂片检查可看出有无细菌，微生物的类 型和大概的数量以及芽胞、形状和位置（芽 胞梭菌）、着色情况及菌体特征。对血性液 体或浓稠分泌物用丫啶橙染色比革兰染色较 易观察。这些初步结果应该及时向主管医生 报告，以帮助他们正确选用抗菌药物。涂片 检查可核对培养结果是实验室质量控制的一 个重要指标。 8. 厌氧菌鉴定 w （1）灭滴灵纸片周围出现抑菌环说明有厌氧菌生长 （绝大多数专性厌氧菌对灭滴灵敏感，兼性厌氧菌耐 药）。 w （2）耐氧试验：接种BRBA平板（需氧厌氧各放一 块）及巧克力平板（置CO2条件下）。 w （3）革兰染色：根据菌落和菌体形态、染色特性可 初步鉴定。 w （
8、4）抗生素敏感性鉴定：BRBA平板上分区划线接 种，第一划线区贴多粘菌素（10g/片）、卡那霉素 （1000g/片）和万古霉素（5g/片）。厌氧菌纯培养 抑菌环直径=10mm为敏感。 表1 级水平实验室革兰阴性厌氧菌群、属、种鉴定 _ 厌氧菌种类 细胞 卡那 万古 多粘 20% 靛基质 脂酶 硝酸盐 尿素酶 动力 凹痕 砖红色 形态 霉素 霉素 菌素 胆汁 还原 荧光 _ 脆弱类杆菌群 B R R R + V 其他类杆菌 B R R V V + 产色素杆菌. R V V V V P.中间型杆菌 CB/B R R S + +- +- P loescheii R R V + 类解脲类杆菌群 S R
9、 S + V V V 解脲类杆菌. B S R S + + V 梭状肛菌属 S R S V V V 革兰阴性球菌 C S R S V 韦荣球菌属 C S R S + + _ R:耐药，S:敏感，V:不定，C:球菌，B:杆菌，CB:球杆菌，P:Prevotella;*甲酸、延胡素酸盐刺激生长阳性 表4-3 级水平实验室革兰阳性厌氧菌群、属、种鉴定 w_ w厌氧菌种类 细胞 已醇芽 卡那 多粘 万古 靛基质 硝酸盐 触酶 卵磷 反向CA 菌体列车 双环 尿素酶 w 形态 胞试验 霉素 菌素 霉素 还原 脂酶 MP试验 状排列 溶血现象 w_ w厌氧革兰阳性球菌 C V R S V w 厌氧消化球菌 C/CB RS R S + V w 不解糖消化球菌
