光学显微镜基础知识讲解

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1、奥林巴斯生物显微镜奥林巴斯生物显微镜 光学显微镜基础知识光学显微镜基础知识 显微镜的光学原理显微镜的光学原理 象差象差 显微镜的技术参数显微镜的技术参数 显微镜的光学部件显微镜的光学部件 基础知识 显微镜成像 F F 物镜 显微镜成像 F F 物镜 显微镜成像 物镜 250mm明视距离 F F 目镜 基础知识 光学显微镜基础知识光学显微镜基础知识 显微镜的光学原理显微镜的光学原理 像差像差 显微镜的技术参数显微镜的技术参数 显微镜的光学部件显微镜的光学部件 理想成像理想成像 点 标本投影图像 点 平面平面 图形 准确 相似 图形 像差 实际图形实际图形 点 标本投影图像 虚的圆 平面 弯曲的面

2、 图形 变形的图 形 像差 象差的种类象差的种类 球差球差 象散象散 慧差慧差 畸变畸变 场曲场曲 色差色差 基础知识 象象 差差 球差球差 象散象散 慧差慧差 场曲场曲 负畸变负畸变 正畸变正畸变 基础知识 场场 曲曲 基础知识基础知识ACHPLAN ACH 场曲场曲 色色 差差 基础知识 色差校正对照 色差校对色差校对 无校对 校对 基础知识 光学显微镜基础知识光学显微镜基础知识 显微镜的光学原理显微镜的光学原理 像差像差 显微镜的技术参数显微镜的技术参数 显微镜的光学部件显微镜的光学部件 显微镜的技术参数显微镜的技术参数 数值孔径数值孔径 分辨率分辨率 工作距离工作距离 焦深焦深 放大倍

3、率放大倍率 同焦距同焦距 同轴度同轴度 基础知识 数值孔径数值孔径( (N.AN.A) ) 基础知识 分辨率分辨率 基础知识 R = k /NA ：波长 NA：数值孔径 K常数: K光镜 = 0.61；KFV = 0.51 数值孔径大分辨率高数值孔径大分辨率高 基础知识 NANA与焦深与焦深 基础知识 工作距离工作距离( (W.DW.D) ) 基础知识 工作距离工作距离 不需要盖玻片不需要盖玻片 有盖玻片有盖玻片 同焦距（齐焦距离同焦距（齐焦距离) ) 基础知识 同轴度同轴度 基础知识 比如10倍物镜下的中心 转换到40倍是仍然几乎是中心 柯勒照明和临界照明柯勒照明和临界照明 基础知识 临界照

4、明临界照明 柯勒照明柯勒照明 基础知识 厚标本和薄标本厚标本和薄标本 4 - 5 um4 - 5 um2um2um 基础知识 基础知识 光学显微镜基础知识光学显微镜基础知识 显微镜的光学原理显微镜的光学原理 像差像差 显微镜的技术参数显微镜的技术参数 显微镜的光学部件显微镜的光学部件 显微镜的主要光学部件显微镜的主要光学部件 物镜物镜 目镜目镜 聚光镜聚光镜 基础知识 物物 镜镜 基础知识 物镜的种类物镜的种类 按色差和场曲校正程度分按色差和场曲校正程度分: : 消色差物镜消色差物镜（Ach)Ach) 平场消色差物镜平场消色差物镜( (PlanAchPlanAch) ) 平场半复消色差物镜平场

5、半复消色差物镜(Plan-FL(Plan-FL或或PLFLPLFL） 平场复消色差物镜平场复消色差物镜（PlanApoPlanApo) ) 平场超级复消色差物镜平场超级复消色差物镜（PlanSApoPlanSApo) ) 基础知识 uVIS NIR范围内优异的色差校正 信 噪 UPLSAPO物镜 消色差 Ach 蓝 (486nm) 和红 (657nm) 半复消色差Fluorite 兰和红 + (绿, 紫色(437nm) 复消色差Apo 437-657nm 超级复消色差Super Apo 430-1000nm 物镜的色差校正 轴向色差侧向色差 ACH 消色差 Ach 蓝 (486nm) 和红 (

6、657nm) 半复消色差Fluorite 兰和红 + (绿, 紫色(437nm) 复消色差Apo 437-657nm 超级复消色差Super Apo 430-1000nm 物镜的色差校正 轴向色差侧向色差 ACH FL IR IR 消色差 Ach 蓝 (486nm) 和红 (657nm) 半复消色差Fluorite 兰和红 + (绿, 紫色(437nm) 复消色差Apo 437-657nm 超级复消色差Super Apo 430-1000nm 物镜的色差校正 轴向色差侧向色差 ACH FL Apo 消色差 Ach 蓝 (486nm) 和红 (657nm)；绿球差 半复消色差Fluorite 兰

7、和红 + (绿, 紫色(437nm)；绿、兰球差 复消色差Apo 437-657nm ，绿、兰、深兰球差 超级复消色差 430-1000nm Super Apo 物镜的色差校正 轴向色差侧向色差 ACH FL S Apo IR IR Apo 消色差物镜消色差物镜 基础知识 复消色差物镜复消色差物镜半复消色差物镜半复消色差物镜 传统物镜的符号传统物镜的符号 基础知识 新物镜的符号新物镜的符号 基础知识 其它物镜其它物镜 基础知识 浮雕相称物镜 无应力偏光物镜 相称物镜 超低倍物镜 带校正环物镜带校正环物镜 基础知识 对载波片和盖玻片厚度的要求对载波片和盖玻片厚度的要求 基础知识 载玻片载玻片:

8、0.9 - 1.4 : 0.9 - 1.4 mmmm 盖玻片盖玻片: 0.17 : 0.17 mmmm 无盖片物镜无盖片物镜 基础知识 物镜光阑的运用 光阑全开启光阑适当关小 荧光观察中应用 目目 镜镜 基础知识 目镜的视场目镜的视场 基础知识基础知识 F F. .N N. . 2222 标本的视场直径标本的视场直径 标本的视场直径标本的视场直径 = = 目镜视场数目镜视场数 / / 物镜倍率物镜倍率 例例: WH10X: WH10X目镜视场数为目镜视场数为2222 物镜为物镜为UPLFL40XUPLFL40X 视场直径视场直径 = 22 40 = 0.55mm= 22 40 = 0.55mm

9、 基础知识 聚光镜 显微镜的调节显微镜的调节 瞳距调节瞳距调节 屈光度调节屈光度调节 光路转换光路转换 聚光镜中心聚光镜中心 孔径光栏设置孔径光栏设置 瞳距调节 屈光度调节 调节 光 路 转 换 100%100%80%80% 20%20%100%100% 聚光镜中心调节聚光镜中心调节 光轴中心调节螺钉光轴中心调节螺钉 视场光阑视场光阑 孔径光阑孔径光阑 10X10X物镜物镜 标本标本 聚光镜升降旋钮聚光镜升降旋钮 孔径光栏调节 N.A聚=(0.6-0.8)N.A物 孔 径 光 栏 开 度 与 图 象 100% 70% 30% HR LC HC LR MR MC 孔径光栏的运用 孔径光栏的运用

10、对比度调节 奥林巴斯显微镜无限远光学系统奥林巴斯显微镜无限远光学系统 UISUIS 显微镜无限远光学系统UIS 有限远 无限远 UIS 光学系统 Merit of the Infinity system 物镜 D/M 重影 平行光线 结像透镜 UIS 系统 Universal Infinity System 万能无限远系统 1. 完美结合分辨率和对比度 -明场高分辨率 -高对比度、高亮度图像 -清晰的 DIC图像 -更敏感的偏光观察 -清晰、色彩明亮的相衬 UIS 系统 Universal Infinity System 2. 系统灵活性 - 无限远校正光学系统 - 物镜和结像透镜完全校正 3

11、. 物镜万能性更强 -A single universal objective lens performs very well in Fluorescence, Nomarski DIC, Phase contrast, Polarized light and, of course, Brightfield -High UV transmission, Strain-free, Perfect correction of Chromatic aberration and other optical aberrations Competition comparison F : Fully Pri

12、mary Correction in objective & tube lens Tc : Tube-lens Compensation 奥林巴斯显微镜无限远光学系统奥林巴斯显微镜无限远光学系统 UISUIS 1增加附件，光路不变，倍率不变，F.N.不变 2中间附件设计更简单，不需增加透镜 3物镜单独完成象差校正，象差校正更高，不需目镜补偿 4更高镜像亮度，荧光效果更好（结象透镜校正） 5接视频效果更好，不需增加照相目镜 相差观察方式 1 原理 利用被检物体的光程（折射率 x 厚度）差进行镜检，即利用 干涉现象，将相位差变为人眼可以分辨的振幅差 共轭面：吸收光线，直射光通过 补偿面：相位推迟，

13、衍射光通过 物镜 相板 聚光镜环状光阑 相差观察方式 2 特点 鉴定活体细胞最实用、最经济的方法 3 缺点 需要光强高 切片不能太厚(210um) 盖片、载片需符合标准 最好配用单色滤光镜 操作较麻烦 荧光效果不如明场物镜 相差观察方式 4 应用： 无色透明活体标本的细微结构，检查, 鉴定活体细胞(培养细胞,分离细胞) 相差观察方式 5 调节： 柯勒照明调节 将相差物镜及附件转入光路（物镜聚光镜相衬环型号匹配） 对样品聚焦 取下目镜，装上CT望远镜， 调节CT焦距看到清晰的相差环 调节聚光镜上定位螺丝，使环状光阑象与相板共轭面重合 荧 光 观 察 方 法 什么是荧光 ? 物质中的电子吸收光的能

14、量由低能状态转变为 高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非 温度辐射光冷光。即：物质吸收短波光，发 射出的长波光。 显微镜荧光利用光源激发光化荧光 荧光显微镜的作用原理 宽谱线发射光（ 汞灯） 滤掉其他光，透过 激发光 激发滤 色片 吸收滤 色片 滤掉激发光，透过 荧光 标本受激发产生 荧光向四周发散 激发光受反射、折射 或衍射向四周发散 荧光的性质 吸收光，必需有激发光源 荧光波长激发波长（损失热能） 荧光强度极小于激发光的强度 有不同程度的衰减 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓 度、荧光效率 荧光显微镜的优点和用途 优点： 检出能力高（放大作用） 对细胞的刺激小（可以活体染色） 能进行多重染色 用途： 物体构造的观察荧光素 荧光的有无、色调比较进行物质判别抗体 荧光等 发荧光量的测定对物质定性、定量分析 荧光显微镜的主要部件 透射式 吸收滤色镜 暗场聚光镜 激发滤色镜 汞灯光源 落射式 吸收滤色镜 分光镜 激发滤色镜 汞灯光源 落射荧光显微镜的构造 吸收滤色镜吸收滤色镜 激发滤色镜激发滤色镜 落射荧光显微镜的构造