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1、中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会 生产的禽重组I F N 。其抗病毒活性降低或丧失。其具体原因有待进一步研究。 参考文献略 鸭瘟弱毒疫苗诱导免疫鸭细胞和体液作用的研究 程志萍1 ，程安春t 汪铭书L 2 ，陈斌L 3 ，刘阐- ，段坤- ，周雪j 陈孝跌1 - 2 ( 1 四川农业走学动物科技学院禽病防治研究中心，四川雅安，6 2 5 0 0 0 ：2 动物疫病与人类健康四川省重 点实验室四川雅安，6 2 5 0 0 0 ；3 四川省兽医防疫总站，四川成都，6 1 0 0 4 1 ) 摘要将鸭瘟弱毒疫苗用肌肉注射免疫2 8 日龄鸭，接种后采血用淋巴细胞增殖试验( M T T
2、法) 测定鸭 外周血T 淋巴细胞转化；用流式细胞仪( F A c s ) 测定c D ，T 淋巴知胞数量的动态变化：用间接E L I s A 法检 测血清抗体水平结果表明：免疫组鸭T 淋巴细胞时c o r L A 的反应能力于2 l t 8 d 显著( 唧0 5 ) 高于空白 对照组；外用血c D ，+ T 淋巴细胞数量于2 l 一2 8 d 极显著唧，0 1 ) 高于空白对照组；血清抗体水平在2 8d 时达到峰值并于l 扣1 8 2d 棱显著( 唧叭) 或显著( P 郢0 5 ) 高于空白对照组表明鸭瘟弱毒疫苗免 疫鸭能产生良好的细胞免疫应答和体液免疫应答，为一种有效的生物制剂 关建词鸭痘弱
3、毒疫苗：细胞免疫；体液免疲 鸭瘟( d u c k p l a g u e D P ) 又称鸭病毒性肠炎( d u c k v i r a le n t e r n i s ，D V E ) ，是由鸭瘟病毒 ( d u c kp I a g u ev i r ，D P V ) 引起的常见于鸭、鹅等雁行目禽类的一种急性、败血性、高度接 触性传染病l lJ 。其发病率和死亡率都甚高，是水禽养殖业的一大危害l “j 。1 9 2 3 年B a u d e t H J 报道荷兰的家鸭暴发了一种急性出血性疾病，D e z e e u w 胪J 证实了B a u d c t 的发现并再次指出病 毒对鸭的专
4、一性，但他认为该病毒是适应了鸭的鸡瘟病毒。1 9 4 2 年，B o s F l 对前人的工作进 行了深入的研究，他认为该病不是由鸡瘟病毒引起的，而是鸭的一种新的病毒性疾病，并提 议称其为“鸭瘟( D P ) ”。1 9 4 9 年，J 锄s e n 和K u n s t 在第十四届国际兽医学会上建议采用鸭瘟 为法定名称。1 9 5 7 年，黄引贤”1 在我国广州发现并报道了鸭瘟，且研制出鸭瘟组织灭活弱 毒疫苗。我国对D P 的预防已有鸡胚化弱毒疫苗p j 。现在已见应用P c R 、定量P c R 等技术 对D P 弱毒在体内的动态分布的研究报告I I “其它大量资料都是对D P v 产生的
5、抗体水平 和保护力等进行研究I l “”，本试验通过T 淋巴细胞转化实验和应用流式细胞仪对c D 3 + T 淋 巴细胞数量监测来检测D P v 引起的细胞免疫应答水平，同时也应用间接E L I s A 检测体液免 疫应答水平进一步阐明了D P 弱毒的免疫机理。 l 材料与方法 1 1 疫苗 鸭瘟弱毒疫苗由中牧股份有限公司提供。鸭瘟强毒株由四川农业大学禽病中心提供。 1 2 实验动物及分组处理 2 8 日龄北京鸭，经E u s A 检测D P v 血清抗体阴性，由四川农业大学水禽场提供。实 验鸭1 0 只随机分为2 组，每组5 只。试验组腿部肌肉注射D P 弱毒疫苗2 0 0 L ( 一个免疫
6、剂量 ，只) ，空白对照组注射等量P B s 缓冲液。 1 3 主要试剂 培养基R P M l l 6 4 0 ( G 1 B C OB R L 公司) ： 小牛血清( H y c l o n e 公司产品) ：刀豆蛋白A ( c 0 1 1 I A ，s i g m a 公司) ；M 兀I s i g m a 公司) ；淋巴细胞分层液( 上海华精生物高科技有限公司) ； 台盼蓝( s j 舯a 公司产品) ；肝素钠( 国药集团化学试剂责任有限公司产品) ；F I T c 标记鼠 抗人c D 3 + 单克隆抗体( B i o L e g e n d 公司) ；丙酮多聚甲醛溶液( 4 5 的丙酮
7、，9 2 5 多聚甲醛) ； 羊抗鸭I g G 酶标二抗( K P L 产品) ：四氨基联苯胺( T M B ) ( A M R E s c O 公司产品，N o ：1 1 7 3 8 5 7 ) ； 牛血清白蛋白( 即B s A 。A M f 也s c O 公司产品N o ：2 3 1 3 8 5 1 ) ；抗原包被缓冲液( p H9 6 ， 为通讯作者 禽类传染病 O 0 5M 磷酸盐缓冲液) 、洗涤缓冲液( p H7 4P B S + 0 0 5 1 、w e n 2 0 ) 、封闭液( 1 B S A ) 、 血清稀释液( 含0 1 B s A 的洗涤缓冲液) 、底物缓冲液( p H
8、5 0 ) 、终止液( 2 M H 2 s 0 4 ) 。 1 4 主要仪器 流式细胞仪( B DF A c Sc a l i b u r ) 酶联免疫检测仪( E L x 8 0 0 型，B i 矾e k 公司) ；超纯水仪 ( L A B C O N C O w a t e r P P S - 9 0 0 0 7 0 3 型) l 细胞培养箱( F o 珊a s 甜船I I 。1 1 l e 衄。公司) ； 普通离心机( s I G M A1 1 5 ) I 洗板机( E L x 5 0 型，B i o - t e k 公司) ；超速离心机 ( B B c I ( 1 姐N ( L E 8
9、 0 K ) 型，美国c o U L T E R 州公司) ：高速冷冻离心机( A 1 l e g 髓T M 2 l R 型) 。 1 S 实验方法 1 5 1 血样的采集和处理 免疫D P 弱毒苗后第3 、7 、1 4 、2 1 、2 8 、3 5 、4 9 、6 3 、8 4 、1 0 5d 颈静脉采血肝素钠 抗凝处理用于分离淋巴细胞作淋巴细胞转化试验；第7 、1 4 、2 l 、2 8 、3 5 、4 9d 颈静脉采血， E D T - A 抗凝处理用于分析T 细胞亚群c 岛+ 数量变化规律；第7 、1 4 、2 t 、2 8 、3 5 、4 9 、6 3 、 8 4 、1 0 5 、1
10、 2 6 、1 5 4 、1 8 2d 颈静脉采凝血，用于检测血清中鸭瘟的抗体水平。 1 5 2 淋巴细胞转化试验 外周血淋巴细胞的分离取肝素钠抗凝血lT n L ，参照文献【1 6 】分离淋巴细胞。最后用 完全R P M I1 6 4 0 培养基( 青霉素2 0 0U L ，链霉素2 0 0m 以，小牛血清1 0 ) 将细胞浓度调 整为5 x 1 0 6 r n L 淋巴细胞的诱导培养取1 0 0u L 单细胞悬液于9 6 孔培养板内，加入C o n A 至终浓度2 0 “咖L ，每个样品设3 个重复孔，置5 C 0 2 、3 7 培养6 8h 后加入M T T ( 5m g ，m L )
11、，1 0H U 孔，继续培养4h 。最后每孔加1 0 0 此l O s D S o 0 4l n o l ，LH C l ( 即酸化的S D S ) 终止反应。 再继续培养2h 检测及数据处理在酶联免疫检测仪上用4 9 0 枷和6 3 0n m 双波长测定0 D 值。数据用 S P S S l 2 O 进行统计学分析。 1 5 3c D ，T 淋巴细胞数量的检测 外周血淋巴细胞的预处理取E D T A 抗凝血1m L ，按1 5 2 方法分离淋巴细胞，用P B S 离心洗涤3 次，将细胞稀释成5 x 1 0 6 m L 。参照文献【1 7 1 取O 2m L 细胞于流式管中加预冷的 P B S
12、 ( 含4 5 的丙酮，9 2 5 的多聚甲醛) ，立即旋涡振荡1 0s ，再用预冷的P B S 洗涤液( 含 0 1 的B S A 和0 1 的叠氮钠) 离心洗涤3 次每次10 0 0r ，m i n 离心5m i n 。最后用预冷P B S 缓 冲液悬浮细胞。 T 淋巴细胞的荧光标记取F I T c 标记鼠抗人c D ，单克隆抗体l o 皿加入上述悬浮细 胞，4 作用4 5 m h ，再加预冷的P B s 缓冲液离心洗涤3 次，每次 10 0 0 r m i n 离心5 m i n 。 弃上清，管底细胞用0 5 札P B s 悬浮。 F A c s 检测及数据处理F A c s 检测1 0
13、 0 0 0 个细胞，获取C D 3 + T 淋巴细胞阳性百分比。 数据用s P S s l 2 0 进行统计学分析。 1 5 4 血清1 2 G 的检测 E L I s A 抗原的制各将D P v 弱毒在鸡胚成纤维细胞上增殖培养，当细胞出现7 0 以 上病变时收获病毒，反复冻融3 次，80 0 0r m i n 离心3 0m i n ，去除细胞碎片，收集上清： 再经3 50 0 0r m i n 离心2 5h ，沉淀用少许超纯水溶解后经蔗糖密度梯度离心纯化，将制各 好的纯化病毒抗原分装2 0 保存备用。 血清抗体I g G 检测采用间接E L I S A 法： ( 1 ) 将E L I s
14、A 抗原用0 0 5MN a H c 0 3 ( p H9 6 ) 稀释成5 p 咖L ，加入酶标板中，1 0 0 p u 孔，4 静置包被过夜。 ( 2 ) 取出，甩去液体，用P B s T ( 含0 3 T w 钟n - 2 0 的P B S ，p H 7 4 ) 洗板3 次，每次3 m i n ， 然后加入1 0 0 “u 孔的封闭液( 含1 B s A ) ，3 7 作用l h ( 3 ) 甩去液体、洗板，加入1 0 0 倍稀释血清样品，1 0 0p L ，孔3 7 作用1 h 。 ( 4 ) 甩去液体、洗板，加入羊抗鸭I g G 酶标抗体( 1 ：6 0 0 稀释) 1 0 0p U
15、 孔3 7 作用l h 。 ( 5 ) 甩去液体、洗板，加入1 M B 1 0 0p “孔，室温作用l Om i n 。 ( 6 ) 加入2 M H 2 S C h 5 0 此终止反应 中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会 样品于波长4 5 0I l I I l 下测定其O D 值。所得数据用s P s s l 2 0 进行统计学分析。 2 结果 2 1 鸭外周血T 淋巴细胞转化效果 用D P 弱毒苗免疫2 8 日龄北京鸭后，在第1 4 6 3 d ，弱毒组鸭外周血T 淋巴细胞对C o n A 的反应能力明显高于空白对照组，其中2 l 以8d 有显著差异( P 如0 5 ) 2
16、2 鸭外周血c D ，T 淋巴细胞数量的动态变化 D P 弱毒免疫鸭后第7d 鸭外周血C D 3 十T 淋巴细胞就开始增多，2 8d 时达到峰值，并于 2 1 2 8d 极显著( P 卯0 1 ) 高于空白对照组。 2 3 鸭血清抗体水平的动态变化 D P 弱毒苗免疫鸭后血清抗体水平在第7d 开始升高2 8d 时达到峰值。其O D 4 5 0 均 值达到0 7 6 。弱毒免疫组于1 4 1 8 2d 极显著( P 郢0 1 ) 或显著( P 郢0 5 ) 高于空白对照组。 3 讨论 3 1D P 弱毒疫苗通过肌肉或皮下注射是使鸭最快获得免疫力的有效免疫途径，免疫鸭后 通常只需几个小时对接种鸭就呈现一定程度保护力1 4 1 “q 。对1 月龄以内雏鸭进行免疫，免 疫期可达1 个月；对1 月龄以上的鸭进行免疫，其血清抗体保护可长达9
