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1、中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第三届第八次学术研讨会论文集( 2 0 0 6 年广州) 种高效的免疫方法。基因枪采用少剂量能产生高效免疫在T a n g h e 等的实验中也得到证实。T a n g h e 用6 8 周龄雌性B A L B c 小鼠间隔3 周肌肉注射或基因枪接种结核病D N A 疫苗3 次，并于最后一次 接种后3 周采血。用E L I S A 测定抗A 9 8 5 A 抗体，并取脾细胞进行细胞毒性T 淋巴细胞( C T L ) 应答测 定。结果显示，在B A L B e 小鼠中，基因枪免疫诱导产生抗体和C T L 应答所需的D N A 质粒量比肌肉注 射免疫剂量低5 0 倍
2、。 值得注意的是在某种情况下，小剂量基因枪免疫能诱导出与大剂量肌肉注射组效果相当或更好 的细胞免疫。这可能与免疫部位的组织特征有关。皮肤组织长期受到许多外源性抗原的攻击会产生 具有增强免疫应答反应的特殊细胞。据报道J ，皮肤组织中丰富的树头状细胞和巨噬细胞可以有效地 完成抗原提呈作用并激活免疫应答，同时皮肤组织中M H C 分子的T h 细胞提呈抗原后产生多种细胞 因子并诱导T 细胞的增殖和分化。另一方面，核酸疫苗直接轰击到靶细胞内，几乎不受到体内核酸 酶的降解作用。 但与基因枪轰击法相比，肌肉注射的核酸疫苗必须通过几道屏障后才能达到目的细胞内，第一、 肌肉纤维和肌细胞膜的物理屏障阻碍核酸疫苗
3、的有效穿透。第二、肌中膜阻挡核酸疫苗的吸收。核 酸疫苗进入细胞核需要一定的时间，因此部分核酸疫苗会被体内的核酸酶降解掉。以上因素在一定 程度上减弱了核酸疫苗的有效导入，这可能是4 , N 量基因枪轰击法比大剂量肌肉注射法诱导效果好 的原因。 本实验还发现，在不含O R F 5 基冈的空载体质粒p c D N A 3 1 ( + ) 组中，C o n A 对猪外周血T 淋巴细 胞有一定的诱导作用，这可能与以下两种因素有关：( 1 ) C o n A 诱导T 淋巴细胞产生的增殖反应是非 特异性的，只要有一定量的T 淋巴细胞就可诱导增殖反应。( 2 ) p c D N A 3 1 ( + ) 质粒中
4、的免疫刺激序列 I S S 具有诱导机体分泌细胞因子的免疫佐剂作用，能增强免疫应答。 综上所述，本实验所采用的基因疫苗p c D N A P R R S V - S C 2 O R F 5 经_ 两种不同免疫途径均能诱导产 生很强的免疫效果。基因枪法和肌肉注射法在临床上都具有良好的应用前景。 参考文献( 编者略) 鸭Q 干扰素基因疫苗对D V H 弱毒苗免疫鸭的细胞免疫调节作用研究 刘闯1 ，程安春1 2 ，汪铭书1 , 2 6 , 陈斌1 ，一，程志萍1 ，段坤1 ，杨梅1 ，周雪1 ，陈孝跃1 2 ( 1 四川农业大学动物科技学院禽病防治研究中心，6 2 5 0 0 0 ；2 动物疫病与人
5、类健康四川省重点实验室，四川雅 安，6 2 5 0 0 0 ；3 p t l ) l l 省兽医防疫总站。I 四) l l 成都，6 1 0 0 4 1 ) 摘要：将鸭a 干扰素( I F N a ) 基因疫苗( p c D N A D u l F N c ) 以5 0 、1 0 0 、2 0 0 I t g 三个剂量分别肌注 免疫2 8 日龄樱桃谷鸭，1 5 天后免疫鸭病毒性肝炎( D V H ) 弱毒疫苗：同时设空载体+ D V H 弱毒疫 苗、生理盐水、D V H 弱毒疫苗以及p c D N A D u l F N a 免疫鸭对照组，3 只鸭组，于D V H 弱毒疫苗 免疫后5 、7 、
6、1 4 、2 l 、2 8 、4 2 、5 6 、7 0 d 采用流式细胞仪( F A C S ) 和淋巴细胞增殖试验( M T T 法) 分别对免疫鸭外周血的C D 3 + 淋巴细胞总数和T 淋巴细胞转化能力进行动态检测。结果：T 淋巴细 胞对C o n A 的反应能力( O D 值) ：D V H 弱毒疫苗免疫后5 - 7 0 d 极显著( P O 0 1 ) 、p c D N A D u l F N a 免疫后7 - 7 0 d 显著( P O 0 5 ) 、空载体十D V H 弱毒疫苗免疫后7 - 4 2 d 极显著( P 0 0 1 ) 高于生理盐水 基金项目：国家科技攻关重大项目(
7、 2 0 0 4 B A 9 0 1 A 0 3 ) ，教育部“新世纪优秀人才支持计划”项目( N C E T 0 4 0 9 0 6 ) ， 四川省教育厅重点项目( 2 0 0 3 A 0 2 4 ) 、四川省基础研究重大项目( 0 5 J Y 0 2 9 1 0 9 ) 和四川省重点建设学科 项目( S Z D 0 4 1 8 ) 作者简介：刘闯( 1 9 8 1 ) 。男。硕士。河南平顶山人。从事禽病学研究工作 程安春和汪铭书为通讯作者T E L ：0 8 3 5 2 8 8 5 5 4 4 ，F A X ：0 8 3 5 2 8 8 5 7 7 4 ，E m a i l ：c h c
8、n g a n c h u n v i p 1 6 3 e o m 3 2 6 中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第三届第八次学术研讨会论文集( 2 0 0 6 年广州) 对照鸭；5 0 、1 0 0 和2 0 0 I J g 的p c D N A D u i F N a 分别与D V H 弱毒疫苗先后免疫后5 - 7 0 d 天极显著 ( P o 0 1 ) 高于生理盐水对照鸭，2 1 - 4 2 d 极显著( P 0 0 5 ) ， 但均高于2 0 0 a g 组。C D 3 + 淋巴细胞数量：D V H 弱毒疫苗、p c D N A D u I F N a 及其空载体+ D V H 弱 毒
9、疫苗免疫鸭后7 - 5 6 d 极显著( P o 0 1 ) 高于对生理盐水对照鸭；5 0 、1 0 0 和2 0 0 1 1 9 的p c D N A D u l F N a 分别与D V H 弱毒疫苗联合免疫后7 - 5 6 d 天极显著( P o 0 1 ) 高于生理盐水对照鸭，1 0 0 肛g 组于7 - 5 6 d 、 5 0 陷组于7 d 2 8 d 、2 0 0 p g 组于7 d 和2 1 4 2 d 极显著( P o 0 1 ) 高于空载体、D V H 弱毒疫苗及其 p c D N A D u l F N n 免疫鸭，l O O p g 组于7 - 4 2 d 显著( p o
10、 0 5 ) 高于5 0 I ，t g 组，且极显著( P 0 0 1 ) 或显 著( p 0 0 5 ) 。研究表明，鸭I X 干扰素 基因疫苗能显著增强鸭细胞免疫力，并能显著增强D V H 弱毒疫苗诱导的鸭细胞免疫力，是一种优秀 的鸭细胞免疫的分子免疫增强剂和D V H 弱毒疫苗细胞免疫的分子免疫佐剂，以p c D N A D u l F N - I X 肌 肉注射1 0 0 p g 只的效果最佳。 关键字：鸭a 干扰素基因疫苗；细胞免疫调节；鸭病毒性肝炎病毒弱毒疫苗 干扰素( I n t e r f e r o n ，I F N ) 是受到病毒感染或各种生物诱生作用后，机体细胞反应产生并
11、分泌的 一类具有多种生物学活性的糖蛋白，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用。目前在禽类中只发现了 I X 干扰素( I F N a ) 和丫干扰素( I F N - ，y ) ，I F N I X 是由动物的白细胞产生，通过在细胞内诱发抗病毒 状态和调节免疫系统，达到中和病毒或清除受病毒感染的细胞的目的，从而发挥抗病毒作用。近年 来，对鸭I F N I X 的研究开始受到重视，S c h u l t z 等( 1 9 9 5 ) 以C h l F N a ( 鸡I F N - a ) 基因为探针，从 绿头野鸭的基因组中克隆了I F N a ( D u l F N a ) 基因，在p E T a
12、- E c o i l 和p c D N A I C O S 7 表达系中进行 了有效表达；S c h u l t z 等( 1 9 9 9 ) 发现重组鸭a 干扰素( r D u l F N I X ) 抑制V S V 、N D V 和A 型流感 病毒( F l u A ) 的增殖，并建立了鸭乙型肝炎病毒( D H B V ) 一干扰素实验用于人类病毒性肝炎的模型 研究：夏春等( 2 0 0 0 ) 克隆了北京鸭I F N a 基因并比较了与绿头野鸭I F N a 基因的差异。目前尚未 见到关于p c D N A D u l F N a 免疫鸭后对鸭细胞免疫的影响和对D V H 弱毒苗所诱导
13、的鸭细胞免疫的影 响的研究资料，为了加深对p c D N A D u l F N a 免疫学活性的认识，检测其对鸭细胞免疫的调节作用， 探索其在生产中的应用价值，本研究以p c D N A D u l F N a 作为免疫调节剂免疫鸭及其与鸭病毒性肝炎 ( D V H ) 弱毒苗联合免疫鸭，通过测定免疫鸭外周血C D 3 + 淋巴细胞数量的动态变化和T 淋巴细胞增 殖试验来检测肌肉注射p c D N A D u l F N a 对鸭细胞免疫的影响和对D V H 弱毒苗的细胞免疫调节作 用，实验结果表明p c D N A 。D u l F N a 能增强鸭细胞免疫力，并能显著增强D V H 弱毒
14、疫苗诱导的鸭细 胞免疫力，报道如下。- 1 材料与方法 1 1 质粒和疫苗 p c D N A 3 1 _ ( + ) 质粒，I n v i t r o g e n 产品；鸭a 干扰素基因疫苗( p c D N A - D u l F N - I X ) ，由本实验室构 建：D V H 弱毒疫苗，本实验室提供。 1 2 实验动物 2 8 日龄樱桃谷鸭，由四川农业大学种鸭场提供。 1 3 主要试剂 ， 7 F I T C 标记的抗人C D 3 + 单克隆抗体( 美国B D 公司产品) ：培养基R P M l l 6 4 0 ( G I B C OB R L 公司产 品) ；刀豆蛋白A ( C o
15、 n A ) 和M T T ( S i g m a 公司产品) ：淋巴细胞分层液( 上海华精生物高科技有限 公司产品) 。 j 1 4 主要仪器 酶联免疫检测仪( E L x 8 0 0 型，B i o t e k 公司) ；流式细胞仪( B DF A C SC a l i b u r ) ：细胞培养箱( T h e r m o 3 2 7 中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第三届S A 次学术研讨会论文集( 2 0 0 6 年广州) 公司，F o r m a S e r i e s I I ) ；普通离心机( S I G M A1 1 5 ) 。 1 5 动物分组、免疫及采样 将2 1 只鸭随
16、机分为3 个实验组和4 个对照组，3 只组。A 组为D H V 弱毒苗+ 5 0 I - t g p c D N A - D u l F N - a 免疫实验组，B 组为D H V 弱毒苗+ 1 0 0 1 x gp c D N A D u l F N 免疫实验组，C 组为D H V 弱毒苗+ 2 0 0 I | t g p c D N A D u l F N a 免疫实验组，D 组为空白对照组，E 组为D H V 弱毒苗+ 空载体对照组，F 组为 p c D N A D u l F N 免疫对照组，G 组为D H V 弱毒苗免疫对照组。 A 、B 、C 组分别肌注p c D N A - D u I F N I x 5 0 p g 、1 0 0 p g 、2 0 0 1 t g 只；D 、G 组各肌注生理盐水，I m l 只；E 组肌注空载体p c D N A 3 1
