鸡胚原始生殖细胞发育调控及其机理的研究

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1、浙江大学博士学位论文 鸡胚原始生殖细胞增殖调控机制的研究 分类号： S8 单位代码： 10335 密 级： 公开 学 号： 10517023 博博 士士 学学 位位 论论 文文 中文题目中文题目: 鸡胚原始生殖细胞发育调控及其机理的研究鸡胚原始生殖细胞发育调控及其机理的研究 英文题目英文题目: Regulation of the Chicken Primordial Germ Cell Development 申请人姓名： 葛 楚 天 指导教师： 张才乔 教授、J. N. Petitte 教授 专业名称： 动物营养与饲料科学 研究方向： 干细胞发育调控 所在学院： 动物科学学院 论文提交日期论

2、文提交日期 二零一零年四月 二零一零年四月 中国杭州 浙江大学博士学位论文 鸡胚原始生殖细胞增殖调控机制的研究 鸡胚原始生殖细胞发育调控及其机理的研究 论文作者签名:论文作者签名: 指导教师签名: 指导教师签名: 答辩委员会主席答辩委员会主席： 刘建新 教授 委员 1： 彭金荣 教授 委员 2： 杜爱芳 教授 委员 3： 胡松华 教授 委员 4： 徐宁迎 教授 委员 5： 张才乔 教授 答辩日期： 2010 年 6 月 5 日 中国杭州中国杭州 浙江大学博士学位论文 鸡胚原始生殖细胞增殖调控机制的研究 Regulation of the Chicken Primordial Germ Cell

3、 Development Authors signature: Supervisor s signature: Examining Committee Chairperson: Professor Jianxin Liu Examining Committee Members: Professor Jinrong Peng Professor Aifang Du Professor Songhua Liu Professor Ningying Xu Professor Caiqiao Zhang Date of oral defence：06/05/2010 浙江大学博士学位论文 鸡胚原始生殖

4、细胞增殖调控机制的研究 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得 浙江大学浙江大学 或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 签字日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 浙江大学浙江大学 有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权 浙江大学浙江大学

5、可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播， 可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 （保密的学位论文在解密后适用本授权书） 学位论文作者签名： 导师签名： 签字日期： 年 月 日 签字日期： 年 月 日 浙江大学博士学位论文 鸡胚原始生殖细胞增殖调控机制的研究 目 录 摘 要 1 Abstract. 4 第一章 文 献 综 述 9 第一节 胚胎干细胞的增殖与分化研究 9 1.1 干细胞的概述.9 1.2 维持 ES 细胞增殖和不分化的因素及其信号转导.11 1.2.1 内源性调控因子12 1.2.2 胞外因子介导的信号途径13 1.3 ES 细胞的体外诱导分

6、化14 1.4 小结.15 第二节 禽类原始生殖细胞的发生和迁移. 16 2.1 禽类 PGC 概况16 2.2 禽类 PGC 的起源 17 2.3 禽类 PGC 的迁移 18 2.4 小结 19 第三节 禽类 PGC 的增殖调控. 20 3.1 PGC 的增殖特征20 3.2 生长因子调控 PGC 增殖21 3.2.1 白血病抑制因子（LIF）21 3.2.2 干细胞生长因子（SCF）22 3.2.3 碱性成纤维生长因子（bFGF）22 3.2.4 骨形成蛋白-4（BMP-4）23 3.2.5 维甲酸（RA）23 3.2.6 其他生长因子23 3.3 细胞信号通路调控 PGC 增殖24 3.

7、3.1 G-蛋白偶联受体途径 24 3.3.2 酪氨酸激酶受体途径 25 3.3.3 丝氨酸/苏氨酸激酶受体途径. 27 3.4 细胞周期相关基因调控 PGC 增殖28 第四节 禽类 PGC 的分化调控. 30 4.1 禽类性腺发育和性别调控的分子机理30 4.1.1 胚胎性腺的发育30 4.1.2 性腺发育的基因调控30 4.1.3 性腺发育的类固醇激素调控31 4.2 PGC 的分化31 4.2.1 RA 在 PGC 分化中的调控32 4.2.2 Nanos2 和 PGC 分化33 I 浙江大学博士学位论文 鸡胚原始生殖细胞增殖调控机制的研究 第五节 禽类 PGC 在制作转基因鸡中的应用.

8、 34 第六节 本研究的目的和内容. 36 6.1 本研究的目的和意义 36 6.2 研究目标及内容. 36 第二章 表皮生长因子对鸡胚原始生殖细胞增殖调控机理的研究. 38 第一节 鸡胚原始生殖细胞的分离、培养及鉴定. 38 1.1 引言.38 1.2 材料与方法39 1.2.1 实验动物.39 1.2.2 主要器材.40 1.2.3 主要试剂及配制.40 1.2.4 饲养层的制备42 1.2.5 血液中 PGC 的分离、纯化和培养.42 1.2.6 生殖嵴和性腺 PGC 的分离、纯化和培养.43 1.2.7 鸡胚 PGC 的染色鉴定.44 1.2.8 RT-PCR 检测 PGC 特异基因的

9、表达.46 1.2.9 性腺切片免疫组织化学染色.49 1.3 结果.49 1.3.1 血液 PGC 体外分离培养及鉴定.49 1.3.2 生殖嵴、性腺 PGC 体外分离培养及鉴定.51 1.4 讨论.55 1.4.1 PGC 的分离及培养55 1.4.2 鸡胚 PGC 的培养条件.56 1.4.3 鸡胚 PGC 的鉴定57 1.5 小结.58 第二节 表皮生长因子对鸡胚原始生殖细胞增殖的影响及其机理的研究. 58 2.1 引言.59 2.2 材料与方法60 2.2.1 实验动物.60 2.2.2 主要器材.60 2.2.3 主要试剂及配制.60 2.2.4 PGC 培养及药物处理61 2.2

10、.5 BrdU 免疫组化62 2.2.6 SSEA-1，NF-B 免疫组化.62 2.2.7 RNA 提取和常规 RT-PCR63 2.2.8 Real-time RT-PCR.63 2.2.9 PGC 蛋白质的提取和 Western Blot 分析64 22.10 数据分析.66 2.3 结果.66 2.3.1 EGF 对 PGC 增殖的影响66 2.3.2 EGFR 在 EGF 对 PGC 促增殖中的作用68 II 浙江大学博士学位论文 鸡胚原始生殖细胞增殖调控机制的研究 2.3.3 PKC 在 EGF 对 PGC 促增殖中的介导作用70 2.3.4 NF-B 在 EGF 对 PGC 促增

11、殖中的介导作用71 2.3.5 EGF 对细胞周期蛋白 mRNA 表达水平的影响72 2.3.6 EGF 对细胞凋亡相关蛋白表达的影响72 2.4 讨论.73 2.5 小结.75 第三章 雌激素对鸡胚原始生殖细胞增殖调控机理的研究. 76 1.1 引言.76 1.2 材料与方法78 1.2.1 实验动物.78 1.2.3 主要试剂及配制.78 1.2.4 PGC 的培养和处理79 1.2.5 E2 注射79 1.2.6 鸡胚性别鉴定.79 1.2.7 吉姆萨染色.80 1.2.8 细胞周期流式分析.81 1.2.9 Brdu 发育 3 浙江大学博士学位论文 鸡胚原始生殖细胞增殖调控机制的研究

12、Abstract Poultry species has always been used as animal model for the research in developmental biology for profound elucidation of the mechanisms underlining poultry development, especially the reproductive system. The reproductive performance of poultry could be greatly improved by external manipu

13、lation based on endogenous regulating mechanisms. In this study primordial germ cells (PGCs) were isolated from Avian chicken embryo, and then subcultured on feed layer after initial primary culture with somatic cells. In addition, the effect of EGF, E2 and Ginsenosides on proliferation of cultured

14、PGCs was evaluated, together with the underlining mechanisms. Meanwhile, we also investigate the effect of RA on the initiation of meiosis in chicken PGCs. These studies will provide theoretic guidance and experimental platform for improving poultry reproductive performance and preparation of transg

15、enic poultry. 1. Isolation, culture and identification of chicken PGCs PGCs were collected from stage 14 chicken embryonic blood, stage 19 embryonic genital ridges or stage 27 embryonic gonads with a fine glass needle under a microsurgery scope. For primary culture, cell suspension containing both PGCs and somatic cells was seeded onto gelatin-treated 35