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2、容外，文中不包含其他人已发表或撰写的研究 成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。 研究生签名： 导师签章：臀南 沙年j ，月27 日 e 1 ， 目录 中文摘要l 英文摘要4 研究论文鬼臼毒素衍生物C I P 一3 6 抗肿瘤多药耐药作用机制研究 前。言- 一”“一一”一”一一“一一”“一”“一”“一8日U 舌”一“”一”一“”一”一“”一”“一”一一“一一”“一”“一”“一“萏 材料与方法9 结果一“一”2 4 附图”一”“一”“一”“一“一”一”一一”一一“一一”“一“”一”2 9 附表6 l 讨论一”一一一”一”一”一7 0 结 仑“一”一”一一一一。7 8 参考
3、文献7 9 综述一”一”一一”一一”“一一一一85 个人简历9 4 中文摘要 鬼臼毒素衍生物C I P 3 6 抗肿瘤多药耐药作用机制研究 摘要 目的：本文研究新鬼臼毒素衍生物C I P 一3 6 对多种多药耐药肿瘤细胞 株和动物移植性肿瘤的抑制作用，并初步探讨其作用机制。 方法： 1M T T 法和S R B 法检测C I P 3 6 的体外抗肿瘤活性。 M T T 法和S R B 法测定C I P 3 6 在体外对各种肿瘤细胞( K B 、K B v 2 0 0 、 H e l a ，S K O V 3 ，B G C 一8 2 3 ，M C F 一7 ，L o V o ，H O S ，S
4、M M C 一7 7 2 1 ，H e p G 一2 ， K 5 6 2 、K 5 6 2 A 0 2 ) 及正常细胞( V E C 、F B ) 的I C 5 0 或G 1 5 0 值。 2 光学和荧光显微镜观察C I P 3 6 作用后肿瘤细胞形态结构的变化。 3 琼脂糖凝胶电泳分析C I P 3 6 对K B v 2 0 0 细胞染色体D N A 断裂的影响。 4 流式细胞术分析C I P 3 6 对K 5 6 2 A 0 2 细胞周期及凋亡率的影响。 5 R T - P C R 法检测不同浓度C I P 3 6 ( 1 I | m o l L 、2 1 t m o l L 、4 p m
5、 o l L ) 对 K 5 6 2 和f 或) K 5 6 2 A 0 2 细胞m d r - 1 、p 5 3 、p 21 、b c l 2 、b a x 、c a s p a s e 3 、P C N A 、 c y c l i n A 、c y c l i n B l 、t o p oI I 伐、t o p oI I1 3m R N A 表达的影响。 6 免疫细胞化学法和W e s t e r n b l o t 法观察不同浓度C I P 3 6 ( 1 l x r n o l L 、 2 I t m o l L 、4 I - t m o l L ) 对K 5 6 2 A 0 2 细胞
6、P g P 蛋白表达的影响。 7 超螺旋p B R 3 2 2D N A 断裂法检测C I P 3 6 对拓扑异构酶I I 伐活性的影响 8 利用动物移植肿瘤模型研究C I P 一3 6 体内抗肿瘤作用。 结果： 1C I P 3 6 的体外抗肿瘤活性 M T T 法检测发现C I P 3 6 对多种贴壁肿瘤细胞均有较好的活性，I C 5 0 为1 4 1 岬o l L 5 9 6 1 x m o l L ；尤其对人口腔上皮癌细胞株K B 效果比较明 显，I C 5 0 为1 4 1 l x m o l L 。S R B 法对K 5 6 2 和K 5 6 2 A 0 2 的G 1 5 0 分别
7、为 1 0 2 9 m o l L 和3 3 4 m o l L 。与阳性对照药依托泊苷比较C I P 3 6 在体外显 示了更强的抗肿瘤活性，且无耐药性出现。同时对人的正常血管内皮细胞 ( V E C ) 、成纤维细胞( F B ) 具有低毒性，对肿瘤细胞有较好选择性。 通过对K 5 6 2 和K 5 6 2 A 0 2 细胞生长曲线的观察，发现C I P 一3 6 对多药耐药 肿瘤细胞及其亲本株都具有生长抑制作用，并呈剂量依赖性，同等浓度的 ，。 ； ； 中文摘要 C I P 一3 6 抑制肿瘤细胞生长活性高于阳性对照依托泊苷( V P 1 6 ) 。 2C I P 3 6 的体内抗肿瘤作
8、用 分别连续腹腔注射C I P 一3 6 ( 2 5 m g k g d 、5 0 m g k g d ) 5 d ，观察其对小 鼠实体型肉瘤$ 1 8 0 的生长抑制率分别为5 5 11 和6 2 7 2 ，高低剂量组与 对照组相比均具有显著性差异( P 0 0 5 ) 与阳性对照组( 依托泊苷) ( P 0 0 5 ) 比，未及依托泊苷组下降明显。说明C I P 3 6 在体内试验表现出 良好的肿瘤抑制作用，且无明显毒副作用。 3C I P 3 6 诱导多药耐药肿瘤细胞凋亡 C I P 3 6 能够诱导K 5 6 2 A 0 2 细胞凋亡，不同浓度的C I P 3 6 ( 1 p m o
9、l L 、 2 9 m o l L 、4 k t m o l L ) 作用于K 5 6 2 A 0 2 细胞2 4 h 后，用G i e m s a 染液和荧光染 料H o e c h s t3 3 3 4 2 对细胞进行染色，并利用光学和荧光显微镜观察。光学显 微镜下观察发现C I P 3 6 可使细胞核染色质发生聚集、碎裂；荧光显微镜下 观察发现低浓度C I P 3 6 可使细胞核膜皱缩，染色质凝集，深染，中高浓度 组多数细胞形成众多大小不等的凋亡小体，具有一定的量效关系。不同浓 度的C I P 3 6 ( 1 m o l L 、2 p m o l L 、4 1 a m o l L ) 作
10、用于K B v 2 0 0 细胞2 4 h 后， 提取总聊妊进行琼脂糖凝胶电泳，呈现显著“D N A 梯子”( D N Al a d d e r ) 。 流式细胞术进行细胞的D N A 含量测定，可见不同浓度的C I P 3 6 ( 1 p m o l L 和4 岬o l L ) 作用于K 5 6 2 A 0 2 细胞6 h 后，即开始出现细胞凋亡，且凋亡细 胞的比例随着C I P 3 6 浓度的升高和作用时间的延长而增加。以上结果从形 态学、生化学、流式细胞仪三个角度均显示了C I P 3 6 能够诱导多药耐药肿 瘤细胞凋亡。 4C I P 3 6 对多药耐药肿瘤细胞( K 5 6 2 A
11、0 2 ) 周期的影响 流式细胞仪分析C I P 3 6 对K 5 6 2 A 0 2 细胞周期移行的影响。经不同浓 度的C I P 3 6 ( 1 p m o l L 、4 9 m o l L ) 分别作用于K 5 6 2 A 0 2 细胞6 h 、1 2 h 、2 4 h 后，发现其中6 h 、1 2 h 细胞周期被阻断在S 期，而2 4 h 细胞周期被阻断在 S G 2 + M 期。 5C I P 3 6 对K 5 6 2 和( 或) K 5 6 2 A 0 2 多药耐药性基因m d r - 1 、t o p o1 10 【、 t o p o I ID ，凋亡相关基因p 5 3 、b c
12、 l 2 、b a x 、p 2 1 、c a s p a s e 3 ，核增殖相关基 因P C N A ，细胞周期相关基因c y c l i n A 、c y c l i n B lm R N A 表达及m d r - 1 编码的 蛋白P g p 表达的影响。 中文摘要 不同浓度的C I P 3 6 ( 1 l x m o l L 、2 p m o l L 、4 9 r n o l L ) 作用于K 5 6 2 和( 或) K 5 6 2 A 0 2 细胞2 4 小时后，R T - P C R 结果显示C I P 3 6 可上调K 5 6 2 细胞中p 5 3 、 p 2 1 、b a x
13、、c a s p a s e 3 、t o p o1 10 Lm R N A 的表达，下调b c l 2 、P C N Am R N A 的表达；在K 5 6 2 A 0 2 细胞中可上调p 5 3 、p 2 1 、b a x 、c a s p a s e 3 、t o p oI I 伐 及c y c l i n Am R N A 的表达；降低了b c l 一2 、m d r - 1 、P C N A 和c y c l i n B lm R N A 的表达，同时发现C I P 一3 6 对K 5 6 2 和K 5 6 2 A 0 2 细胞中t o p oI IB 的m R N A 表达 无影响
14、。免疫细胞化学法结果显示不同浓度的C I P 3 6 ( 1 I - t m o l L 、2 l a m o l L 、 4 9 m o l L ) 均可使K 5 6 2 A 0 2 细胞P g P 蛋白的表达量降低，且呈一定的剂量 依赖性；同时w e s t e r n b l o t 结果也显示了相同的结果。 6C I P 3 6 对拓扑异构酶I I 仪活性的影响 C I P 3 6 通过稳定酶D N A 药物复合物的存在，从而抑带l J T o p oI I 仅活性， 并较同浓度的阳性对照药依托泊苷强，且有一定的剂量依赖性。 结论：C I P 3 6 在体外能够抑制多种人源性肿瘤细胞并
15、对多种多药耐 药肿瘤细胞株无耐药性，与阳性对照药依托泊苷比较C I P 3 6 在体外显示 了更强的抗肿瘤活性。在体内，C I P 3 6 对于小鼠移植性S 1 8 0 肉瘤有较好 的抑制作用。C I P 3 6 抗肿瘤作用机制可能与以下途径有关：l 、p 5 3 途径： 上调p 2 1 、b a x 及c a s p a s e 3 基因表达，同时协同下调m d r - 1 基因及b c l 一2 基因的表达；2 、上调t o p o 1 10 【基因表达，抑制T o p oI I 伐催化活性；3 、下 调核增殖相关基因P C N A 表达抑制肿瘤细胞增殖；4 、下调m d r - 1 的表达 产物P g P 蛋白的表达；5 、上调c y c l i n
