《骨髓基质细胞在梗塞心肌与非缺血心肌中的分化》由会员分享，可在线阅读，更多相关《骨髓基质细胞在梗塞心肌与非缺血心肌中的分化（37页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、武汉大学 硕士学位论文 骨髓基质细胞在梗塞心肌与非缺血心肌中的分化 姓名：潘国栋 申请学位级别：硕士 专业：人体解剖与组织胚胎学 指导教师：宋健 20040501 中文摘要 目的: 观察急性心肌梗塞环境是否影响移植的成年骨髓基质细胞( MS c ) 的存活、 增殖以及向心肌样细胞分化。 方法:采用成年近交系 Wi s t a r 大鼠，分离双侧胫股骨全骨髓细胞，于2 0 % F B S 的高搪型D M E M培养基、 3 7 0C , 5 %C 仇 条件下培养。 差速猫附法纯化M S c ， 传代 扩增细胞，D A P I 荧光标记。利用左冠状动脉前降支结扎建立急性心肌梗塞模型。术 后 I 周
2、。 将等量已标记的MS c分别植入梗塞区和非缺血区的心肌中， 在移植后1 , 2 , 4周取材，连续冰冻切片。荧光显微镜观察两注射部位 MS c的数量和分布范围，免 疫组织化学方法观察MS c在两种移植环境下心肌特异性肌钙蛋白T T n T )的表达。 比较梗塞区与非缺血区MS c在细胞计数和T n T阳性率方面的差异。 结果:培养的全骨髓细胞增殖较快，一般原代培养 4 - 6天可传代，传代培养 3 - 4 天可再次传代。经 2 - 3次传代后，贴壁细胞全部纯化为均一的成纤维细胞样 MS C e D A P I 标记的成功率接近 1 0 0 %。 冠脉结扎 1 周以后， 模型动物的左室壁形成圆
3、形梗塞 灶。 荧光镜下. 移植 1 周、 2 周、 4 周的组织切片中， 移植的MSc胞核呈现蓝色荧光， 在梗塞区和非缺血区心肌中都可以找到。移植 1周，非缺血区的 MSc计数 ( 5 1 7 0 .2 5 1 5 4 8 . 5 1 )和 T n T阳性率 ( 1 A 1 % + 0 . 3 4 )与梗塞区 ( 5 6 9 5 .0 0 + 6 3 1 .4 3 和2 . 3 2 0/ . 1 0 . 7 6 ) 无显著差异 ( P 0 .0 5 ) 。 移植2 周，非缺血区的MSc主要聚集在注射点周围.增殖和 扩散均较慢。而梗塞区的MS C增殖较快，扩散明显，部分细胞渗透到与梗塞灶边缘 交
4、界的心肌纤维之间。 梗塞区的MSc在细胞计数 ( 1 5 0 2 2 .2 5 1 9 9 1 .2 9 ) 和 T n T阳性率 ( 9 . 1 7 % + 2 .4 8 ) 方面均显著高于非缺血区 ( 7 5 6 6 .8 8 1 8 3 9 .9 8 和4 .2 9 % + 0 .7 4 P 0 .0 5 ) 。而在 T n T阳 J性率方面 结论 梗塞区 ( 1 4 .7 6 % 1 3 .3 2 )仍然显著高于非缺血区 ( 8 .9 7 0/ . 1 1 . 1 2 P 0 .0 5 ) . T w o w e e k s a ft e r t r a n s p l a n t a
5、 t i o n , m o s t MS C s i n n o n - is c h e m i a a r e a s t i l l lo c a t e d a r r o u n d t h e i n j e c t i o n s i t e w i t h o u t o b v i o u s m i g r a t i o n . I n i n f a r c t e d a r e a , h o w e v e r , MS C s p r o l i f e r a t e d a n d m i g r a t e d q u i c k l y , s o m
6、 e MS C s i n f i l t r a t e d i n t o h o s t m y o c a r d i u m . T h e c e l l n u m b e r s a n d T n T p o s i t i v e r a t e s o f MS C S i n i n f a r c t e d a r e a ( 1 5 0 2 2 .2 5 1 9 9 1 .2 9 a n d 9 . 1 7 % 1 2 .4 8 ) w e r e s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h o s e in
7、 n o n - i s c h e m i a a r e a ( 7 5 6 6 .8 8 1 8 3 9 .9 8 a n d 4 .2 9 % 1 0 . 7 4 P 0 .0 5 ) . T h e T n T p o s i t v e r a t e s o f M S C s , h o w e v e r , in i n f a r c t e d a r e a w e r e s t i l l h i g h e r t h a n t h a t i n n o n - i s c h e m i a a r e a ( 1 4 .7 6 % 1 3 .3 2 v
8、s 8 .9 7 % 1 1 . 1 2 , P 0 .0 5 ) C o n c l u s i o n : MS C c a n s u r v i v e i n A M e n v i r o n m e n t . F u r t h e r mo r e , A MT e n v i r o n m e n t c a n s t i m u l a t e MS C p r o l i f e r a t i o n a n d m i g r a t io n , a n d i s m o r e i n f a v o r o f MS C d i ff e re n t
9、i a t i o n i n t o c a r d i a c my o c y t e s . K e y w o r d s :Ma r r o w s t r o m a l c e l l ; My o c a r d i u m ; My o c a r d i a l i n f a r c t i o n ; C e l l i m p l a n t a t i o n ; D i ff e r e n t i a t i o n 郑重声明 本人的学位论文是在导师指导下独立撰写并完成的， 学位论文没 有票 窃、抄袭、造假等违反学术道德、学术规范和侵权行为，本人 愿意承担由此
10、而产生的法律后果和法律责任，特此郑重声明。 学 位 论 文 作 者 。签 名 ) : i, I司 # 二 时 华 年 犷月了 日 引言 心肌梗塞一直是全球发病率、死亡率都很高的疾病。几十年来，随着心脏介入、 冠脉搭桥手术、药物溶栓等技术的发展，心梗急性期的死亡率已经明显下降。但心梗 病人的远期预后仍然较差，多数陈旧性心梗会逐渐合并进行性加重的充血性心功能衰 竭和心律失常。 严重影响病人寿命和生活质量。 这主要是因为绝大多数成年心肌细胞 不能再生，梗死的心肌只能由 无收缩功能的疤痕组织修复，为维持足够的心输出量， 残存的心肌细胞不得不承担过量的负荷。而长期负担过重导致残存心肌细胞进行性凋 亡，
11、心 功能 进一 步 减 退， 形 成 恶性 循 环 U 。目 前 临 床采 用的 治 疗手 段， 如改 善 心 肌 供 血、减少心脏前后负荷、使用强心试等，只能部分改善症状，不能从根本上使坏死心 肌再生。因此疗效通常有限，也不能中止和逆转病情的进一步恶化.而近年兴起的细 胞移植技术，将外源性细胞通过各种途径导入到受损心肌中，使其代替损失的心肌执 行泵血和传导功能，有望从根本上解决这一难题. 理论上，可供移植的细胞必须具备代替受损心肌细胞工作的能力，对于非心肌的 细胞而言，通常需要具有在一定条件下转分化心肌细胞的能力。此外移植细胞最好还 应具备一定的增殖能力， 以及时补充病程中不断丢失的心肌细胞
12、。 就目前的研究而言， 符合上述条件的细胞主要有胚胎心肌细胞 ( F e t a l c a r d i o m y o c y t e )、骨骼肌卫星细胞 ( S a t e l l a t e C e l l )、 胚胎干细胞 ( E m b ry o n i c s t e m c e l l , E S ) 和骨髓基质细胞 ( M a r r o w s t r o m a l c e l l , MS C )等2 1 MS C是一种存在于骨髓中的， 中胚层来源的非造血系统干细胞。 具有很强的增殖 能力 和多 重分 化潜能 3 1 。 目 前己 发 现， M S C 可以 分化为 成
13、骨、 软骨、 脂肪、 胰岛、 肝、 神 经元 等多 种 类型 细 胞 (4 ) 。 在一 定 条 件下， M S C 也 具 有 分 化为 心 肌 样细 胞的 能 力 5 1 与其它细胞移植相比，MS C移植具有明显的优越性。MS C可以进行自体移植， 避免了胚胎心肌细胞和胚胎干细胞无法克服的细胞来源和伦理学方面的限制，也不存 在免疫排斥反应。 而与骨骼肌卫星细胞自 体移植相比， M S C自 体取材非常方便， 不需 要大面积切除组织。 病人痛苦很小，可以多次重复取材。因此，MS C是一种非常理想 的用于移植的种子细胞。 M S C的 分 化具 有明显 的 环境依 赖性， 将其与 心 肌细胞混
14、 合培养 p q 或移植到 体内 心 肌中 都可以 观察到M S C向 心肌样细 胞分 化6 1 。 从 临 床治 疗角 度考虑， 最理 想的 移植部 位应该是心梗修复期的梗塞区，因为这样被移植的 M S c可以迅速、直接地参与损伤 修复。 但这一阶段梗塞区仍然存在缺血缺氧、部分炎 症细胞浸润、 成纤维细胞增生等 病理改变。这些改变是否会不利于MS c的存活，影响MS c向心肌样细胞分化，目前 还不明确。本实验将 M S c分别植入梗塞区和非缺血区心肌中，观察、比较两种环境 中MS c的存活、 增殖及向心肌方向分化情况，以期获得急性心肌梗塞环境对MS c影 响程度方面的资料。 材料与方法 1
15、实验动物 近交系W i s ta r 大鼠， 雄性， 体重2 0 0 - 2 5 0 g ， 月 龄3 月左右， 中国科学院上海实 验动物中心提供。 2 .试剂和仪器 2 . 1主要试剂 高糖型D ME M培养基 ( G i b c o公司) :胎牛血清 ( F C S . G i b c o公司) ;胰蛋白酶 ( D i b c o 公司) ; 谷 氨酞胺 ( S i g m a 公司) ;D A P I ( 7 1 - 0 3 - 0 0 . S i g m a 公司) : 小鼠 抗 大 鼠 心肌特异性肌钙蛋白T ( T r o p o n i n T , T n T ) 单抗 ( M S
16、 - 1 2 6 0 - P 0 , N e o m a r k e r s 公司) ; F I T C 标记 羊抗小鼠I g G多 抗( Z F - 0 3 1 2 ， 北京中山公司) ; O C T 包埋剂( S a k u r a 公司) ; 其它常用生化试剂均为国产分析纯。 2 . 2主要试剂的配制 ( 1 ) 2 0 % F C S 的D M E M培养液:D M E M 1 .0 8 g . N a H C 0 3 2 .2 0 g ， 谷氨酞 胺 2 .9 2 g , 青 霉 素1 万 单 位， 链霉 素0 .0 1 g ， 加 双蒸 水 至8 0 m l ， 用1 m o V L N a O H 调p H 值 至7 .2 - 7 .4 . 0 . 2 2 1 m滤膜过滤除菌， 加入2 0 m 1 胎牛 血清。临用前新鲜配制。 ( 2 ) 无钙镁D H a n k s 液: K C 1 0 . I g , K H 2 P 0 4 0 .0 1 5 g , N a C l 2 .0 g , N a H C 0 3 0 . 8 7 5 g , N
