精子功能检测的进展.

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1、精子功能检测的进展 南方医科大学华银医学检验中心 胡勇华 一、精子功能检测的概要和意义 二、精液常规显微镜检查 三、精子获能和精子受精功能检测 四、精子核成熟度和精子染色体非整倍性检测 五、精子凋亡检测 六、精子功能流式细胞仪检测的发展 七、总结及展望 内 容 4.精子在女子生殖 道获能及运送 1.数量 2.活力 3.形态 5.精卵识别 6.顶体反应 7.释放蛋白水解酶 9.男子生殖核的形成 一、精子功能检测的 概要和意义 8.穿透透明带 WHO检查指标： 1、精液外观 2、精液量 3、酸碱度 4、液化时间 5、粘稠度 6、精子聚集与凝集 7、精子浓度 8、精子活动率 9、圆细胞浓度及分类 1

2、0、精子形态学染色分析 二、精液常规显微镜检查 精液常规检查中容易忽略的几个问题： 1、精液标本的采集方式和患者的情绪会影响样本采集的完 整性。 2、如果比较两次的精液常规检查结果，必须考虑相同的禁 欲时间和患者相同的状态。 3、粘稠度高不等同于液化异常。不液化的精液标本呈现非 均质粘稠，而粘稠度高的精液标本所呈现的是均质性粘性 ，并且其粘稠度不随时间而变化。 4、精子总数可以衡量睾丸产生精子的能力和男性输精管道 畅通的程度，精子浓度受精囊腺和前列腺分泌液量的影响 （Eliasson et al.,1975），不是衡量睾丸功能的特异性指标。 5、圆细胞浓度检测和分类的重要性 精液中的白细胞和不

3、成熟的生精细胞统称为圆细 胞。正常精液中，有90%的圆细胞为未成熟生精细胞， 并且数量很少。 临床检测圆细胞浓度超过1x106/ml时，就需要进一 步通过染色进行分类，并且准确测定它们的浓度，这 对诊断不育病因十分重要。 常用的染色方法有：区分不成熟生精细胞可以用 瑞-吉染色；区分白细胞可以用白细胞过氧化物酶染色 和全白细胞（CD45）免疫细胞化学染色。 精液中脱落生精细胞的形态示意图 （曹兴午，精液生精细胞检查与临床意义，中华检 验医学杂志2006年10月第29卷第10期） 白细胞过氧化物酶染色的白细胞示意图（棕色 ） 全白细胞（CD45）免疫细胞化学染色结果示意图 研究样本情况睾丸活检病理

4、结果精液脱落细胞学检查结果 15例自愿者（均为妻子怀孕待产）可见各级生精细胞及精子1、能见少量各级生精细胞及大量 精子者1例，占6.7%； 2、见到少量初级精母细胞、次级 精母细胞、精子细胞和大量精子者 3例，占20%； 3、见到少量次级精母细胞、精子 细胞和大量精子者10例，占66.7% ； 4、仅见少量精子细胞和大量精子 者1例，占6.7%。 12例少精子症者可见少量精原细胞、精母细胞、次 级精母细胞，有少数晚期精子细胞 1、检查出包括精原细胞在内的大 量各级生精细胞2例，占16.7%； 2、有大量初级精母细胞、次级精 母细胞、少量晚期精子细胞和精子 8例，占66.7%； 3、有大量精子细

5、胞和极少量精子2 例，占16.7%。 10例原发性睾丸功能障碍1、仅见精原细胞、支持细胞6例； 2、睾丸曲细精管生精细胞完全缺 失，生精上皮仅支持细胞组成者4 例。 1、见有少量精原细胞、支持细胞 及生殖道上皮细胞6例； 2、见有支持细胞、生殖道上皮细 胞4例。结论：精液脱落细胞学检查与睾丸活检的病理结果具有一致性。 （黄宇峰，精液脱落细胞的研究与临床应用，临床检验杂志1996年第14卷第1期 ） 目前还没有来自有生育力男性精液中过氧化物酶阳性 细胞的参考范围，WHO第四版精液分析手册中确定的精 液白细胞症临床诊断标准为1x106/ml。 Cooper 通过研究证实现有的过氧化物酶染色方法很

6、难精确到1x106/ml这个标准，所以白细胞精液症临界值的 确定一直存在诸多分歧，因此临床迫切需要建立新的标准 和更可靠快速的检测方法学。 （Cooper, Improving Precision in the Assessment of Round Cell Numbers in Human Semen, 2010） 6、精子形体学分析必须按照严格标准进行评估 所谓严格标准，是指严格评估精子形态（细分为头部、颈部 和中段以及尾部）和过多残留胞浆，只有以上标准都正常的精 子才认为是正常的。 使用严格标准，精子头部形状比大小更重要。精子头部形态 异常往往和DNA碎片的增加（Gandini et

7、al., 1988）、染色质结构 异常（Lee et al., 1996）、不成熟染色质（Dadoume et al., 1988 ）和非整倍体（Devillard et al., 2002）相关。卷尾可能提示附睾 功能障碍（Pelfrey et al., 1982）。过多的残留胞浆与精子的发育 相关，并有研究显示，活性氧( ROS) 与过量的残留胞浆小滴呈正 相关（Esfandiari N et al., 2003）。 精子形态学分类标准(Kruger Kilinc F et al., 2004;J Moretti E et al., 2007;Theas MS et al., 2006;A

8、ssinder S et al., 2007）。 生精细胞凋亡发生在三个阶段：首先是在A型精原细胞的 有丝分裂阶段；其次是精母细胞的减数分裂阶段；最后是精子 的形成阶段。 生精细胞凋亡的意义在于维持精子发生过程的动态平衡， 维持支持细胞与生精细胞的最佳比例，清除异常生殖细胞，调 节生精过程中精子的数量和质量。在病理状态下，生精细胞凋 亡则导致少精子或无精子症发生。 （Kilinc F et al., 2004;J Moretti E et al., 2007;Theas MS et al., 2006;Assinder S et al., 2007） 成熟精子的凋亡主要发生在精子离开睾丸后的阶

9、段。诱 发精液中精子凋亡的主要因素是活性氧（ROS）损伤。 人精液中的活性氧物质由精子和白细胞产生。 精子内源性的活性氧物质主要来自线粒体分泌的过氧化 氢，外源性活性氧物质主要是超氧阴离子。 （Aitken Alvarez et al., 1987 ; Iwasaki Chen Z et al., 2006;Zhang HB et al., 2008;Lv YiQing et al.,2009） 较高的凋亡指标检测水平已经被证实与精子穿透 卵母细胞的能力呈负相关性。与正常能穿透卵母细胞 的精子相比，低穿透能力的精子往往含有很高的凋亡 率（Grunewald et al., 2008）。 精子凋

10、亡指标的流式细胞仪检测方法： PS翻转：Annexin V-FITC/ PI检测 MMP：JC-1检测 阴性对照阳性结果 凋亡中期：CP3活化率检测 凋亡晚期（精子DNA碎片化）： 1、TUNEL（脱氧核糖核酸N末端标记法）检测 2、SCSA（精子染色质结构分析法）检测 SCSA检测结果示意图 （Evenson PD et al., Sperm Chromatin Structure Assay: Its Clinical Use for Detecting Sperm DNA Fragmentation in Male Infertility and Comparisons With Oth

11、er Techniques, Journal of Andrology,2002） SCSA评估精子DNA碎片化的指标： 1、HDS：精子DNA高染性指数，代表精子染色质结构 的致密性。HDS10%，表示染色质结构不致密，精子 DNA容易损伤，与核蛋白的组型转换相关。 2、DFI：精子DNA碎片化指数，代表精子DNA的损伤 率。 DFI15% ：表示DNA碎片含量低，具有生育的潜能 ； 16% DFI30% ：表示DNA碎片含量中等，存在一定的 不育风险； DFI30% ：表示DNA碎片含量高，生育潜能低下。 精子DNA碎片化检测的意义： 1、不育、自发流产、胚胎停育病因分析 2、妊娠结局的预

12、测 3、辅助生殖助孕方式的选择 （Lara Tamburrino et al., Mechanisms and clinical correlates of sperm DNA Damage, Asian Journal of Andrology (2012) 14,2431） 近几年国外对精子DNA碎片化研究情况汇总表 46 46 精子DNA碎片检测检测 与ART选择选择 47 精子DNA碎片与IVF/ICSI关系 我中心采用SCSA方法对经体外密度梯度离心纯化 前后的精子DFI和HDS进行了研究，发现处理后HDS明显 降低，而DFI在HDS5%时，会明显升高。说明体外精子优化处理对精 子D

13、NA损伤的程度因精子染色质致密程度不同而不同。 因此在实施IVF或者ICSI时，应检测精子的DFI和HDS 。对于那些不成熟较高的精子，应考虑使用其它的体外 优化方法，以免对精子DNA产生损伤，降低流产风险。 DFI正常结果示意图 DFI异常结果示意图 南方医科大学华银检验中心SCSA结果示意图 诱发精子凋亡因素的流式细胞仪检测 1、精子ROS损伤流式细胞仪检测： 二氯荧光乙酰乙酸盐（DCFH-DA）是一种可以通过 细胞膜的染色剂，一旦被过氧化氢等氧化，便产生荧 光。 通过DCFH-DA与PI配套使用，可以鉴别活精子的 ROS损伤程度。 2、精液全白细胞（CD45）流式细胞仪检测： 采用FIT

14、C标记鼠抗人CD45单克隆抗体，可以特异性 检测精液中全部的白细胞。通过加入等量的已知浓度 的荧光计数微球可以实现对精液白细胞群的绝对计数 ，并能区分活力白细胞与死亡白细胞。 多参数联合检测是精子功能流式细胞仪检测技术 发展的方向。 我们在参考大量国外文献的基础上，创立了多指 标联合检测精液的FCM技术，并引入精子顶体特异性 标记物CD46，从而实现了对精子浓度、凋亡、质膜完 整性和顶体完整性的同步联合检测。我们称之为精子 受精能力FCM检测技术。 六、精子功能流式细胞仪检测的发展 精子受精能力FCM检测结果示意图。 Q4-1为质膜完整的活力精子群，Q1-1为死亡精子群，Q3-1为早期凋亡的精子群 ，Q2-1为晚期凋亡的精子群，Q4为发生自发顶体反应的活力精子群，Q2为顶 体外膜消失的死亡精子群。 1、精子凋亡的研究，为临床诊断男性不育的病因、研 究治疗路径开辟了新的方向。 2、流式细胞学检测技术在男科学领域的应用，使得传 统以形态学检查为主的男性精液分析步入了细胞分子 生物学水平。 3、多激发光、多参数联检的新流式细胞术，必将为未 来的男科学研究提供更广阔的视野。 七、总结与展望 谢 谢！ 联系电话：13823752861 联系邮箱：oldhu69