基因工程仪器操作系统(二).

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1、基因工程仪器操作系统（二 ） 主讲人：高凤山 主要内容 n超净工作台 n培养箱 n灭菌消毒设备 n蛋白表达系统 第一节 超净工作台 n一、普通超净工作台 n二、生物安全柜 一 、普通超净工作台： 垂直流层、水平流层 超净工作台是一种局 部净化设备，即利用空气 净化技术使一定操作区内 的空间达到相对的无尘、 无菌状态。使用时，必须 放置在洁净的空间。其接 种数量不受无菌空间的限 制，操作比较简便，可以 较大幅度地提高工作效率 ，适用于大规模生产。为 了保证接种成功率，接种 时使用酒精灯，效果更好 。 n超净工作台可分不锈钢型和全钢型 n超净工作台运作原理及应用方法 超净工作台的优点是操作简单自如

2、，较为舒适， 工作效率高，预备时间短，开机十分钟以上即可操作 ，基本上可随时使用。在工厂化生产中，接种工作量 很大，需要经常长久地工作时，超净台是很理想的设 备。超净台由三相电机作鼓风动力，功率145260W 左右，将空气通过由特制的微孔泡沫塑料片层叠合组 成的“超级滤清器”后吹送出来，形成连续不断的无 尘无菌的超净空气层流，即所谓“高效的特殊空气” ，它除去了大于0.3m的尘埃、真菌和细菌孢子等等 。超净空气的流速为2430m/min，这已足够防止附 近空气可能袭扰而引起的污染，这样的流速也不会妨 碍采用酒精灯或本生灯对器械等的灼烧消毒。工作人 员就在这样的无菌条件下操作，保持无菌材料在转移

3、 接种过程中不受污染。 n超净工作台上部为过滤、送风单元，两侧面是起支撑作用的箱 体，中部设有全钢、不锈钢工作台。 n工作台面与过滤、送风单元之间为净化工作区，侧面设有照明 灯及紫外灭菌灯各一只，辐射波长为2537A，光照度300LX。 n外壳采用316不锈钢、1.2mm冷轧钢材质(表面酸洗磷化再经环 氧树脂静电粉末喷涂)。 n过滤器：初效过滤器采用无纺布制作，高效过滤器由长纤维过 滤纸与铝合金外框构成，具有初阻力小、容尘量大过滤效率高 、使用寿命长、便于更换等特点。 n脚轮：螺杆式制动脚轮 n洁净等级：100级0.5um（美国联邦209E） 粒径：0.5um的尘埃，3.5粒升 风速0.320

4、.48ms（可调） 菌落数：0.5个/皿时（90培养平皿） 噪音：62dB(Decibel )（A） 震动半峰值：3um 垂直双面流层 单人超净工作台 二、生物安全柜（Biological safety cabinets, BSCs） 1.生物安全柜介绍 n是为操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等 具有感染性的实验材 料时，用来保护操 作者本人、实验室 环境及实验材料， 使其避免暴露于上 述操作过程中可能 产生的感染性气溶 胶和溅出物而设计 的。 当操作液体或半液体，例如摇动、倾注、搅拌，或 将液体滴加到固体表面上或另一种液体时，均有可能产 生气溶胶。在对琼脂板划线接种、用吸管接种细胞培养

5、瓶、采用多道加样器将感染性试剂的混悬液转移至微量 培养板中、对感染性物质进行匀浆及涡旋震荡、对感染 性液体进行离心以及继续动物操作时，这些实验室操作 都可能产生感染性气溶胶。 由于肉眼无法看到直径小于5m的气溶胶以及直径 为5100 m的微小液滴，因此实验室工作人员通常意识 不到这样大小的颗粒在生成，并可能吸入或交叉污染工 作台面的其他材料。已经表明，正确使用生物安全柜可 以有效减少由于气溶胶暴露所造成的伤害。 2.生物危害（Biohazard） 一种对人体能产生有害因子的生物源性的力量，例如：由植物 和动物传播的微生物、毒素和过敏原感染和毒害人。 实验室生物安全（Biosafety ） 为防

6、止实验室的生物危害采取合适的实验程序和操作，使用必 要的防护设备保证人员及环境的安全。 年月日，卫生部法监司在北京召开生物安全 实验室认证管理专家研讨会呼吁： 尽快：建立机构、制订法规。 落实：建设前论证、建设后验收、使用中监督。 年月日，国家科技部召开“全国生物安全实验 室管理工作会议”实验室生物安全应纳入法制管理 根据：“实验室生物安全通用准则” 据所处理的微生物及其毒素的危害程度分为四级，依次为： 一级生物安全防护实验室（BSL-1） 无致病作用的微生物，如教学的普通微生物实验室等 二级生物安全防护实验室（BSL-2相当于P2 ) 具有中等潜在危害的微生物。 ( 其中“P”的定义为Phy

7、sical Protecton物理的保护 / Physical containment物理的防护 ) 三级生物安全防护实验室（BSL-3相当于P3 ) 呼吸传播，使人传染严重甚至是致病微生物及其毒素，传播 途径明确，目前已有疫苗 四级生物安全防护实验室（BSL-4相当于P4 ) 高度危险性，通过气溶胶传播或传播途径不明，目前尚无疫 苗或治疗方法的致病微生物及其毒素。 3. 生物安全实验室的划分 一级生物安全防护实验室 无须使用生物安全柜 应穿工作服，手上皮肤有破损戴手套 实验室设计和建造无特殊要求： 有可开启的窗户，应设置纱窗，设洗手池， 围护结构内表面应易于清洁。 地面应防滑、无缝隙，不得铺

8、设地毯。 实验台表面应不透水，耐腐蚀、耐热， 有专门放置生物废弃物容器的台（架） 二级生物安全防护实验室（BSL-2） 适用于： (1) 含漱液、血清和血液等样品的诊断检测 (2) 溶液、固定或用其他方法处理灭活的病毒和/或无传 染性病毒基因片段 （3）常规的细菌和毒素检测 （4）能产生气溶胶的样品处理 （5）临床样品的包装、分装 （6）离心管和离心机转头的封闭与开启 BSL-2 Laboratory 4. 使用生物安全柜的场所 如下情况使用生物安全柜 ： （1）致病微生物气溶胶或 溅出的操作应在生物安全 柜 （级生物安全柜为宜 ） （2）处理高浓度或大容量感染性材料均须在生 物安全柜 (级安

9、全柜为宜）或物理抑制设备中 进行，并使用个体防护设备。 （3）上述材料的离心操作如果使用密封的离心 机转子 或安全离心杯，且它们只在生物安全柜中 开闭和装载感染性材料，则可在实验室中进行。 总结： 生物安全防护将是今后临床实验室建设的重要 基础设施,进行传染性标本的操作的临床实验 室应配备生物安全柜 今后临床实验室的建设应具备二级实验室的生 物安全性,传染病专科医院或三级综合医院至 少要一个城市要 有一个P3实验室 级生物安全柜 至少装一个高效过滤器对排气进行净化， 工作空间为经高效过滤器净化无涡流单向流空气。 正面推拉窗打开一半，上为观察窗，下为操作窗。 外部空气由操作窗口吸进，而不能逸出。

10、 既保证工作人员不受侵害， 也保证实验对象不受污染（工作原理见图） 5. 生物安全柜原理及分型 级生物安全柜 级生物安全柜 四大要素： 1. 物理屏障 2. 高效过滤 3. 空气屏障 4. 定向层流 机理 HEPA Filters（过滤器） 诱捕效应 静电效应 拦截效应 沉降效应 扩散效应 小于0.3 um 的病毒通过HEPA Filter渗透测试结果显示，每 30,000,000 个颗粒中才有1 2个可以通过过滤器 三级生物安全柜 至少装一个高效过滤器对排气净化，工作空间为经高效 过滤器净化的无涡流单向流空气。正面上部为观察窗，下部 为手套箱式操作口。箱内对外保持负压可确保人体与柜内 物品全

11、隔绝。 三级生物安全柜 如图： 第二节 培养箱 内 容 提 要 一、 电热恒温培养箱 二、 细胞培养箱 三、 厌氧培养箱 一、电热恒温培养箱 n电热恒温培养箱适合于普通的细菌培养和 封闭式细胞培养，并常用于有关细胞培养 的器材和试剂的预温。 n电热恒温培养箱分为： n隔水式电热恒温培养箱 n气套式电热恒温培养箱 n电热恒温培养箱结构 n电热恒温培养箱使用与注意事项 n电热恒温培养箱的常见故障及排除 一、电热恒温培养箱 电热恒温培养箱结构 隔水式恒温培养箱的电器结构图 主要由箱体、 加热器、鼓风 机和温控仪等 几部分组成 电热恒温培养箱使用与注意事项 n隔水层的加水 n温度设定 n温度显示值修正

12、 n上限跟踪报警设定 n控温仪的PID（单向可控硅调节）自整定控制 隔水层的加水 n第一次使用时，打开水龙头低水位指示灯亮且伴 有报警声，当水位逐渐升高，低水位指示灯灭报 警声消失时，应及时关闭水龙头。 n若溢水口有水溢出时,应把放水塞头拔出放水，同 时观察溢水口，没有水溢出时应立即将塞头塞紧 。直至低水位无声、无报警、没水溢出。 智能控温仪的温度设定 n按控温仪的功能键“SET”进入温度设定状态，SV 设定显示闪烁，再按移位键配合加键或减键，设 定结束按功能键“SET”确认。设定结束后培养箱 进入升温状态，加热指示灯亮。当箱内温度接近 设定温度时，加热指示灯反复多次忽亮忽熄 ，表示控制进入恒

13、温状态。 电热恒温培养箱的常见故障及排除 故 障 现现 象故 障 原 因排 除 方 法 无电电源指示 1电电源线线未插好或断线线 2熔断器开路 1插好电电源插头头、检查电检查电 源线线 2更换换熔断器 箱内温度不上升 1设设定工作温度小于环环境温度值值； 2控温仪损仪损 坏 3风风机损损坏 4电热丝电热丝 接点接触不良或电热丝电热丝 断 5继电继电 器(或接触器)触点接触不良 1.调调整设设定温度 2.更换换控温仪仪或风风机 3. 旋紧电热丝紧电热丝 接点螺母或更换电热换电热 丝丝 4. 清洁继电洁继电 器(或接触器)的触点 设设定温度与箱内 温度相差过过大或 温度达到设设定值值 后仍大幅度上

14、冲 1温度传传感器损损坏 2过过于频频繁地开关箱门门 3. 物品放置过过密 4. 控制参数偏差 1.更换换温度传传感器 2.尽量减少开关箱门门的次数 3.保证热证热 空气在工作室内正常循环环 4.修正控制参数 超温报报警异常 1设设定温度过过低 2控温仪损仪损 坏 1.调调整设设定温度 2.更换换控温仪仪 漏水 1.箱体损损坏1送厂家修理 二、 细胞培养箱 n细胞培养是指从体内组织取出细胞，在体 外模拟体内生理环境下，使其生长繁殖 ，并维持其结构和功能的一种体外培养技 术。 nHarrison，1907年首次体外培养细胞成功 。 n细胞培养三大必备设施：一个无菌实验室 、一台超净工作台和一个细

15、胞培养箱。 细胞培养 对生长环境 要求 无菌环境恒定的温度气体环境细胞培养基 二、 细胞培养箱 细胞培养箱 n细胞培养箱的工作原理 n细胞培养箱的分类与结构 n细胞培养箱的性能指标 n细胞培养箱的使用注意事项及常见故障的排除 n细胞培养箱的临床应用 细胞培养箱的工作原理 细胞培养箱工作原理图 细胞培养箱的工作原理 细胞培养箱气路原理图 细胞培养箱的工作原理 n温度是通过电热丝加热,再通过箱内温度传感器检 测温度变化 , 使箱体内的温度恒定在设置温度。 n箱内温度一般设定在370.2左右。 n二氧化碳浓度是通过二氧化碳浓度传感器来进行 检测的。 n二氧化碳传感器是用来检测箱体内二氧化碳浓度，将 检测结果传递给控制电路及电磁阀等控制器件，调节 二氧化碳的浓度。 细胞培养箱的分类与结构 加热方式 不同 气套式 细胞培养箱 水套式 细胞培养箱 供气种类不同 二氧化碳培养箱 三气细胞培养箱 灭菌功能不同 普通细胞培养箱 高温灭菌培养箱 细胞培养箱的分类： 细胞培养箱的结构 n细胞培养箱的结构由六部分组成 ： n温度控制系统 n气体控制系统 n湿度控制系统 n内门加热系统 n污染物的控制系统 n微处理控制和信号显示系统 二氧化碳培养箱的结构 细胞培养箱的结构