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1、基金申请技巧讲座 第四军医大学科研部 苏景宽苏景宽 第一部分 如何撰写申请书 一、摘 要(限400字) 包括:研究方法、内容、目标、科学意义。 如:采用方法,进行研究, 阐明机制或揭示规律, 为奠定基础提供思路。 作用:画龙点睛 效果:引发评议专家的兴趣,使其产生探个究竟的好奇心 “他到底是怎么做的 ? ” 采用改良的消减杂交技术建立老年性白内障晶状 体上皮细胞差异表达基因文库并制备基因芯片,利用 此芯片筛选出白内障相关基因。通过基因转染在体和 培养的晶状体上皮细胞,观察细胞的形态、增殖和凋 亡、骨架蛋白及晶状体蛋白的变化,研究基因的功能 。从晶状体上皮细胞的角度阐明老年性白内障发生的 分子生
2、物学机制,为防治白内障提供新思路和理论依 据。 二、立论依据 对基础研究,着重结合国际科学发展趋势, 论述科学意义 对应用基础研究,着重结合学科前沿,围 绕国民经济和社会发展中的重要科技问题 论述应用前景 在立论依据的阐述中,对研究领域、研究方向、 具体科学问题的理解 研究领域:白内障的研究,包括发病机制、预防、诊断、 治疗措施等研究 研究方向:白内障发病机制的研究,包括环境因素、致病 靶点、细胞水平、分子水平研究等 科学问题:白内障发病过程中的相关基因研究,包括致病 基因筛选、功能研究、调控机制、信号转导等 在研究领域层面 从研究方向展开 围绕某一具体科学问题 (本项目研究目标) 进行归纳分
3、析 提出研究 设想 从研究领域切入 研究意义 国内外现状分析 1、项目的研究意义 存在问题:对科学意义的阐述不足或夸大 撰写方法: 从领域入手,提出主要问题,引出热点研究方向。 围绕热点研究方向进行简要分析,找出目前尚未解决的 具体科学问题,以此为切入点提出假设,阐述如果解决了该 问题(研究目标),对该领域甚至相关领域的科学贡献(理 论意义或应用前景)。 老年性白内障是与年龄相关的疾病,随着年龄的增 加,其发病比率也不断升高。特别是人类趋向老龄化, 白内障的患病人数还将持续增加。目前,它已是人类 第一位的致盲疾病。迄今为止, 治疗白内障唯一有效的 方法是通过手术摘除混浊的晶状体并植入人工晶状体
4、。 虽然手术后患者可以恢复良好的视力,但是不可避免的 术后并发症以及手术设备、材料耗资巨大,治疗白内障 所花费的资金已成为世界各国包括富裕的发达国家严重 的医疗负担。最近的调查表明,如果把老年性白内障的 发病时间延缓10年,白内障手术的数量就会减少45%1。 所以,一些学者认为通过预防白内障发生或延缓其发展 的途径征服白内障已成为一项全球性的社会和社会经济 问题2。 但是目前我们对老年性白内障发病机理的认识还不十分 清楚。多年以来许多学者的研究结果证实晶状体上皮细胞在 老年性白内障发生中起重要的作用,但对其中进一步的基因 调控知之甚少。如果从参与老年性白内障晶状体上皮细胞变 化的相关基因入手,
5、研究基因的生物学功能,有可能抓住引 起白内障发生、发展的主要环节。据此,本研究拟利用改良 的消减杂交技术和基因芯片技术准确、全面、快速的特点, 以晶状体上皮细胞为研究对象,一次性筛选出老年性白内障 全部有差异表达的基因,从中再筛选出与白内障相关基因, 并着重对其功能进行研究,从基因水平阐明白内障的发病机 制,为防治白内障提供新思路和理论依据。 2、国内外现状分析(与综述的区别) 存在问题: A、低水平重复:不了解最新进展,对国内外现 状缺乏真正了解,提出的问题别人已解决。 B、文献复习不全:检索文献方法不当、选择关键词 不妥,甚至人为缩小检索范围。 C、总结表达不够:对国内外现状缺乏归纳分析,
6、 只是简单罗列,缺乏逻辑性和针对性。 D 、对方法原理理解不够:对研究方法不熟悉,简 单移植或夸大其作用,缺乏实际应用的可行性。 撰写方法:要紧紧围绕本次申请项目的主题。 A、从领域切入,简要论述国内外研究成果,并引 出当前的热点研究方向。 B、从研究方向展开,较详细地分析国内外的研究 进展,阐明在该方向上存在的问题。 C、围绕存在的问题,结合国内外以往的研究结果、 当前的现状及今后的发展趋势,详细论述和分 析这些问题产生的原因,提出该方面的空白点、 未知数、以及研究的难点、焦点,从而为自己 申请项目确立研究目标奠定充分的立论基础。 D、对拟采用的技术方法进行介绍和分析。 成熟的方法重点介绍可
7、以应用于本研究的理论依 据和实验依据。 新方法在详细介绍其原理的基础上,阐明可以应 用于本研究的理论依据和实验依据。 需特别注意的问题:必须对所运用的技术方法的 原理、流程尤其是在实际运用中可能出现的问题要十 分清楚,绝不能是一种简单的移植。 例如:抗体 + 功能基团,理论上可以实现融合, 但存在“活性、表达载体选择、纯化等问题。 E、提出本项目的研究设想。 防治白内障必须针对其发病的主要环节。多年以来 ,国内外学者从不同的角度探讨白内障的发生机理。就 致病的环境因素讲,氧化因子、紫外线辐射、晶状体周 围环境中离子浓度改变及一些生长因子、细胞因子的改 变均与老年性白内障的发生有关。就研究的部位
8、分,晶 状体中皮质与核的蛋白质改变及晶状体纤维的改变与白 内障的形成有关,而位于晶状体前囊膜下单层的晶状体 上皮细胞在白内障的形成中的变化更引人关注。 因为晶状体上皮细胞是晶状体中唯一有分裂活性、 数量相对稳定的细胞,它们分裂、分化出晶状体纤维细 胞、产生晶体蛋白,终生不停息,形成了晶状体均一、 对称的结构,对维持晶状体的透明起重要作用。不仅如 此,晶状体上皮细胞还是晶状体中受外来刺激影响较早 的部位,已有研究证实老年性白内障的晶状体上皮细胞 还发生退行性变、细胞膜通透性增加、细胞内酶活性改 变、细胞数量减少、凋亡细胞增多等改变,与单纯老化 的晶状体之间存在差异3-5 。 体外实验也证实多种因
9、素(H2O2、UV-B、晶状体 蛋白的自身抗体)诱发的白内障模型中晶状体上皮的损 伤是晶状体混浊的主要环节6-8。因此,从晶状体上皮 细胞的变化入手探讨白内障的成因,有可能抓住揭示白 内障发病机理的主要环节。而晶状体上皮细胞变化的基 因调控机制是问题的关键所在,也是有待我们深入研究 的问题。 白内障的形成与晶状体的老化密不可分,是晶状 体老化的极端表现。晶状体的老化是多种因素相互作用 的结果,包括基因的和非基因的随机变化的不断积累, 也有程序性的、非随机性的组织特异性多种基因表达的 改变。目前,国内外对白内障相关基因的研究主要以下 三方面: 一是对体外培养的晶状体白内障模型及上皮细胞的 研究。
10、UV-B辐射作用诱导的白内障中晶状体上皮细胞是 主要的靶细胞,其Na-K-ATP酶的活性增加,蛋白质的合 成和分泌增加;上皮细胞的凋亡增加,其中有c-fos基因 的表达增加;还有组蛋白H4、H3 的低表达和蛋白酶C 、-肌动蛋白、-肌动蛋白基因的高表达9-12。 Carper等13利用RT-PCR-DD(reverse transcription- polymerase chain reaction differential display)技术 研究H2O2诱导的晶体上皮细胞的基因差异性表达结果显 示NADH脱氢酶4亚基、细胞色素b、谷氨酰胺转移酶基 因表达减少以及细胞因子的核蛋白、替代拼接
11、因子2 ( alternative splicing factor)、-三羟基异丁酰辅酶A 水解酶基因表达的增加。 二是利用转基因动物的研究。波形纤维蛋白基因( vimentin)、杂交的型中间纤维蛋白基因的转基因小 鼠表现出白内障,而且有随小鼠年龄增加白内障加重的 趋势。晶状体改变的共同特点是晶状体纤维细胞分化受 抑制14,15。Gong等16报告晶状体的细胞膜蛋白连接 蛋白3(3 Connexin)基因敲除小鼠(knockout mouse)在晶状体形成的早期及纤维细胞分化早期不受 影响,其后出现与晶状体蛋白溶解有关的核性白内障。 虽然体外实验和白内障转基因小鼠都提示我们一些基 因的变化与
12、白内障有关,但是,这些变化的基因是否与 老年性白内障形成有关,目前尚缺乏进一步的报告。 三是对人老年性白内障晶体上皮的研究。Lee17 利用RT-PCR技术研究显示前极性白内障与核性白内障上 皮细胞中纤维连接蛋白、I型胶原纤维、-平滑肌蛋白、 TGF-1、TGF-2、TGF-型受体、结缔组织生长因 子的基因表达有差异。Kantorow等18利用RT-PCR- DD研究老年性白内障与正常晶状体上皮的基因差异性表 达的初步结果是老年性白内障有三个高表达基因和12个 低表达的基因。但就DD-PCR技术来讲,在实验中难以 解决假阴性、假阳性以及克隆全长cDNA的问题。 上述三方面的研究均取得了不同程度
13、的研究结果, 但由于当时技术条件的限制都未能全面阐明与白内障相 关的基因及其功能。 寻找白内障时晶状体上皮细胞与正常晶状体上皮细 胞间差异表达的基因有可能揭示白内障的发病机理。 寻找差异表达基因的经典方法是消减杂交技术( subtractive hybridization, SH),它是,但是实验 操作复杂。 经过改进后的抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization ,SSH是Diatchenko等1996 年建立的方法)简化了实验操作,但仍然问题很多。 我校生化教研室建立了改良消减杂交技术19,20, 其特点是:简便易行,能够获得目的细胞特异表达
14、的全长 基因,对低丰度基因也能有效分离。 该方法的建立者已利用这一技术从脂多糖刺激前后的 人牙髓细胞的差异表达的基因中克隆到脂多糖刺激后特异 表达的基因,其中5个为新基因。同理,利用此方法也能 快速、有效地获得白内障晶状体上皮细胞与正常晶状体上 皮细胞间差异表达的基因,并克隆到全长cDNA,为进一 步的结构和功能研究打下基础。 基因芯片技术的出现,使检测差异表达基因和未知 DNA分子变得更快捷、准确、高效。基因芯片是在1996 年被提出并开始研制的,该技术是将成千上万的DNA探 针集中到1厘米见方的基片上,利用碱基互补原理,DNA 探针中的已知碱基序列与被测定的未知DNA分子杂交后 由标记分子
15、标记杂交体,经自动阅读设备分析杂交结果, 从而对检测基因进行定性、定量和结构分析,确定未知 DNA分子。 由于目前尚没有针对白内障研究的现成基因芯片, 根据本研究的需要,我们将筛选到的差异表达的所有基 因建立cDNA文库,再利用基因芯片技术制备成基因芯 片,以此检测多个样本中白内障晶状体上皮细胞与正常 晶状体上皮细胞间差异表达的基因,从中进一步筛选出 白内障特异的基因,它们中可能有已知基因,也可能有 未知基因。通过以上两种技术的有机结合,我们能更快 捷、有效、准确地得到白内障相关基因。 综上所述,分子生物学技术的发展为研究白内障 发生过程中的功能基因及特异调控基因提供了有利武 器。本项目从晶状体上皮细胞入手,利用改良的消减 杂交技术和基因芯片技术系统