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1、细细 菌菌 的的 革革 兰兰 染染 色色 法法 一、实验目的一、实验目的 1 1、了解革兰染色的原理。、了解革兰染色的原理。 2 2、掌握革兰染色的方法。、掌握革兰染色的方法。 3 3、掌握细菌的基本形态和结构。、掌握细菌的基本形态和结构。 二、试验原理二、试验原理 细菌先经碱性染料结晶紫染色，再经碘液细菌先经碱性染料结晶紫染色，再经碘液 媒染后，用酒精或丙酮脱色，再用复染剂媒染后，用酒精或丙酮脱色，再用复染剂 （番红）染色，如果细菌不被脱色而保持（番红）染色，如果细菌不被脱色而保持 原来染料的蓝紫色者，为革兰氏阳性菌；原来染料的蓝紫色者，为革兰氏阳性菌； 如果被脱色，而被染上复染剂的红色者则
2、如果被脱色，而被染上复染剂的红色者则 为革兰氏阴性菌。为革兰氏阴性菌。 革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌染色差别的原因革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌染色差别的原因 G+G+菌细胞壁结构致密菌细胞壁结构致密( (肽聚糖层厚肽聚糖层厚) )，且脂质含量，且脂质含量 少，乙醇不易渗入少，乙醇不易渗入脱色脱色。 G-G-菌细胞壁结构疏松菌细胞壁结构疏松( ( 肽聚糖层薄肽聚糖层薄) )，且脂质含量多，乙醇溶解脂质后易，且脂质含量多，乙醇溶解脂质后易 渗入细胞而脱色。渗入细胞而脱色。 G+G+菌菌体含有大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶菌菌体含有大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶 紫牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇脱色。
3、紫牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇脱色。 G-G- 菌菌体核糖核酸镁盐含量小，易被乙醇脱色。菌菌体核糖核酸镁盐含量小，易被乙醇脱色。 G+G+菌等电点比菌等电点比G-G-菌低，在同一菌低，在同一pHpH值条件下阳性值条件下阳性 菌比阴性菌所带负电荷要多，故与带正电荷的碱菌比阴性菌所带负电荷要多，故与带正电荷的碱 性染料性染料( (结晶紫结晶紫) )结合牢固，不易被乙醇脱色。结合牢固，不易被乙醇脱色。 三、试验材料三、试验材料 显微镜、酒精灯、火柴、牙签、载玻片、显微镜、酒精灯、火柴、牙签、载玻片、 吸水纸、擦镜纸、香柏油、二甲苯、生理吸水纸、擦镜纸、香柏油、二甲苯、生理 盐水、蒸馏水盐水、蒸馏
4、水 草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏（草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏（LugolLugol）碘）碘 液、液、 95%95%乙醇、蕃红红染液乙醇、蕃红红染液 口腔中的细菌口腔中的细菌 四、操作步骤四、操作步骤 1 1、标本片制备、标本片制备 取载玻片取载玻片1 1块，加块，加1 1滴生理盐水。用牙滴生理盐水。用牙 签小心轻刮自己舌苔几下，盐水中混匀涂签小心轻刮自己舌苔几下，盐水中混匀涂 成一薄层。成一薄层。 在室温下自然干燥。在室温下自然干燥。 用片夹夹住玻片通过火焰用片夹夹住玻片通过火焰3 3次固定标次固定标 本，自然冷却。本，自然冷却。 2 2、染色、染色 初染：初染：在固定好并已冷却的涂片标本上滴加
5、在固定好并已冷却的涂片标本上滴加 结晶紫染液，要盖满涂膜。约结晶紫染液，要盖满涂膜。约1 1分钟后，用细水流分钟后，用细水流 从玻片的一端把游离的染液洗去。从玻片的一端把游离的染液洗去。 媒染（增加染料与细胞的亲和力）：媒染（增加染料与细胞的亲和力）：滴加卢滴加卢 戈碘液数滴，作用戈碘液数滴，作用1 1分钟后，轻轻水洗。分钟后，轻轻水洗。 脱色：脱色：在玻片上加在玻片上加95%95%乙醇乙醇2323滴，并轻滴，并轻 轻转动玻片数秒钟，使玻片倾斜让乙醇流去，如轻转动玻片数秒钟，使玻片倾斜让乙醇流去，如 此重复数次，直至流下的乙醇几乎无色或稍成淡此重复数次，直至流下的乙醇几乎无色或稍成淡 紫色，流
6、水冲洗。紫色，流水冲洗。 复染：复染：滴加稀释复红染液数滴，作用滴加稀释复红染液数滴，作用1212 分钟后流水冲洗。分钟后流水冲洗。 3 3、结果判定、结果判定 染色完毕，用吸水纸将标本片吸干，玻片染色完毕，用吸水纸将标本片吸干，玻片 上滴加香柏油，油镜观察。注意观察菌体上滴加香柏油，油镜观察。注意观察菌体 的形态、大小、排列和染色。的形态、大小、排列和染色。 五、注意事项五、注意事项 1 1、决定革兰染色成败的关键是脱色程度。、决定革兰染色成败的关键是脱色程度。 若脱色过度，即使是若脱色过度，即使是G+G+菌，其蓝紫色也会被脱去菌，其蓝紫色也会被脱去 而染上红色，被误认为是而染上红色，被误认
7、为是G-G-菌（假阴性）。若脱色菌（假阴性）。若脱色 不足，即使不足，即使G-G-菌也因蓝紫色被保留而染不上红色，菌也因蓝紫色被保留而染不上红色， 被误认为被误认为G+G+菌菌( (假阳性假阳性) )。脱色程度又受脱色时间。脱色程度又受脱色时间 、涂片之厚薄、脱色时载玻片摇晃的快慢及酒精用、涂片之厚薄、脱色时载玻片摇晃的快慢及酒精用 量多少等因素的影响，无法严格规定。一般可用已量多少等因素的影响，无法严格规定。一般可用已 知知G+G+菌和菌和G-G-菌作练习，以掌握脱色时间。当要确菌作练习，以掌握脱色时间。当要确 证一个未知菌的革兰反应时，应同时另作一张已知证一个未知菌的革兰反应时，应同时另作
8、一张已知 G+G+菌和菌和G-G-菌的混合涂片，以资对照。菌的混合涂片，以资对照。 五、注意事项五、注意事项 2 2、涂片以薄而匀为佳，切不可浓厚。、涂片以薄而匀为佳，切不可浓厚。 过于密集的菌体，因脱色不均匀常呈假阳过于密集的菌体，因脱色不均匀常呈假阳( (阴阴) )性。镜性。镜 检时，要以分散开的细菌着色为准。检时，要以分散开的细菌着色为准。 3 3、做革兰染色的菌种，以培养、做革兰染色的菌种，以培养1824h1824h为宜。为宜。 一般情况下一般情况下G-G-菌的染色反应较稳定，不易受菌龄的影菌的染色反应较稳定，不易受菌龄的影 响；而响；而G+G+菌菌, ,有的在幼龄时呈阳性，培养有的在
9、幼龄时呈阳性，培养2424和和48h48h以上，以上， 由于细胞老化或死亡也可变为阴性反应。由于细胞老化或死亡也可变为阴性反应。 4 4、不宜使用放置过久的碘液，以免影响固定结晶、不宜使用放置过久的碘液，以免影响固定结晶 紫的作用。紫的作用。 六、作业六、作业 绘图：油镜下观察到的细菌及染色状况绘图：油镜下观察到的细菌及染色状况 。 革兰染色结果记录革兰染色结果记录 菌名菌名菌体颜色菌体颜色菌体形态菌体形态G+G+或或G-G- 七、思考题七、思考题 1 1、试比较革兰阳性菌和革兰阴性菌细胞壁、试比较革兰阳性菌和革兰阴性菌细胞壁 结构的特征？结构的特征？ 2 2、革兰染色有什么实际意义？、革兰染
10、色有什么实际意义？ 3 3、当你对一株未知菌进行革兰染色时，怎、当你对一株未知菌进行革兰染色时，怎 样能确证你的染色技术操作正确，结果可样能确证你的染色技术操作正确，结果可 靠？靠？ 附表：革兰氏染液配制附表：革兰氏染液配制 1.1.草酸铵结晶紫染液草酸铵结晶紫染液 A A液：结晶紫（甲紫）液：结晶紫（甲紫）2.0g+95%2.0g+95%酒精酒精20ml20ml B B液：草酸铵液：草酸铵0.8g+0.8g+蒸馏水蒸馏水80ml80ml 混合混合A A液、液、B B液，静置液，静置4848小时后使用小时后使用 2.2.卢戈氏碘液卢戈氏碘液 碘片碘片1.0g+1.0g+碘化钾碘化钾2.0g+2.0g+蒸馏水蒸馏水300ml(300ml(先将碘化钾溶解先将碘化钾溶解 在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后 ，加足水分即成，加足水分即成) ) 3.95%3.95%酒精酒精 4.4.番红复染液番红复染液 番红（沙黄，碱性藏红花）番红（沙黄，碱性藏红花）2.5g+95%2.5g+95%酒精酒精 取上述配好的番红酒精溶液取上述配好的番红酒精溶液10ml10ml与与80ml80ml蒸馏水混匀即成蒸馏水混匀即成
