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1、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术研究人血清转铁蛋白稳定性及裂解产物第35卷2007年6月分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告ChineseJournalofAnalyticalChemistry第6期791796基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术研究人血清转铁蛋白稳定性及裂解产物卓慧钦金宏伟黄河清”黄慧英蔡宗苇(厦门大学生命科学学院细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室,附属中山医院临床检验中心,化学生物学福建省重点实验室,厦门361005)(香港浸会大学化学系,香港999077)摘要制备质谱纯人血清转铁蛋白(HTF),供分子结构分析.选用SDSPAGE,胶外酶解,基质辅助激光解
2、吸/电离质谱技术(MALDITOF),数据库检索和比对技术鉴定铁饱和HTF,双铁HTF(HTF.2Fe”),单铁HTF(HTFFe”)和脱铁HTF(apoHTF)的稳定性和裂解产物.以乙腈溶液作为洗脱相,发现铁饱和HTF在RPHPLC分离纯化过程中产生裂解现象.铁饱和HTF和HTF一2Fe”经乙腈处理后均能产生不同分子量的短肽裂解产物,指出HTF结构稳定性与络合铁离子数量有关.铁组分改善了HTF分子结构的稳定性.采用比对法,研究在乙腈作用下HTF裂解成为各种各样短肽的规律,初步阐明其裂解机理.在乙腈作用下,HTF可能通过蛋白质去折叠途径,形成不同多聚态HTF或多肽裂解产物.推测目前用于临床诊断
3、先天性糖基化紊乱(CDG)和慢性酒精滥用(CAA)疾病低准确率的起因可能是受HTF裂解产物或多聚体的干扰.关键词血清转铁蛋白,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱,胶内酶解,反相高效液相色谱,标志蛋白质1引言转铁蛋白(transferrin,TF)是一类非血红素结合铁的.球蛋白,由单一肽链组成,糖基化约占6%,主要存在于脊椎动物体内.血清转铁蛋白,卵转铁蛋白,乳铁蛋白和黑素转铁蛋白共同组成转铁蛋白家族,家族成员多数具有结合铁离子的同源性末端(C.和N.端),2j.HTF的主要生理功能是负责运输铁或协助调节机体的铁平衡.HTF在C-端结构域具有两个N-连接的糖基化位点,分别位于Asn和Asn川;根据
4、N.连接寡聚糖链末端的唾液酸数目不同,又可分为双触角,三触角,四触角结构.糖链缺乏转铁蛋白(carbohydrate.deficienttransferrin,CDT)通常作为诊断先天性糖基化紊乱(CDG)和慢性酒精滥用(CAA)的重要蛋白质标记物;而等电聚焦技术(IEF)是用于诊断CDT最常用方法,也是诊断CDG的标准之一.此外,免疫比浊法和离子交换色谱法均适合于测定CDT患者血清中HTF相对含量.由于HTF和它的同分异构体的IEF迁移率很靠近,且样品预处理步骤繁琐,因而时常引起假阳性诊断结果J.本研究通过非变性梯度PAGE,不连续PAGE电泳和电转移回收胶内蛋白等方法,获得质谱纯HTF.采
5、用反相高效液相色谱(RP.HPLC)与质谱非在线联用技术研究HTF的组成,分子结构,裂解产物和稳定性等理化特性,旨在为今后提高诊断CDG和CAA疾病准确率或降低假阳性率提供科学合理的诊断技术,并为今后深入研究HTF转铁途径和机理提供分子结构信息.2实验部分2.1仪器,试剂与材料ReflexHI型MALDI.TOF质谱仪(德国Bruker公司);1100高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司).基质芥子酸(SA),2一氰_4.羟肉桂酸(CHCA)和2,5一二羟基苯甲酸(DHB)(美国ICN生物医学公司);三氟乙酸,乙腈(纯度为99%)属于HPLC级(TEDIA公司);电泳试剂(丙烯酰胺,甲叉丙烯
6、酰胺等)均购于上海生物工程有限公司.200610-25收稿;20o7l-31接受本文系国家自然科学基金(No.30470372)和厦门大学预研基金(No.2004xdcx207,xdkicx20051009)资助项目Email:分析化学第35卷健康人群的血清(厦门大学附属中山医院临床检验中心):取50份不同人的血清样品混匀,起到消除个体之间的非疾病引起的差异性,样品在一20保存备用.2.2实验方法2.2.1非变性梯度PAGE制备HTF取人血清约为8mL,每mL血清中加入25LNaHCO(500mmol/L)和18IxLFeC1(10mmol/L)混匀,随后置于37oC2h.经铁饱和后的血清样品
7、与缓冲液(样品缓冲液1mol/LriffsHC1(pH6.8)600IxL,甘油5mL,1%溴酚蓝1mL,超纯水3.4mL)以4:1(v/v)混匀,放置0.5h后离心10min.经粗分离后的HTF选用梯度(4%10%)PAGE(gradientPAGE,PAGE)再次分离,其中浓缩胶工作电压为80V,分离胶工作电压为100V,分离时间1012h.电泳后,层析胶上呈现清晰可见的桔红色蛋白带;沿条带边缘切下,并将条带切成小胶块,采用电转技术(100V)电转,收集HTF.用截留分子量为50kDa的超滤管,超滤810次.在此期间不断补充超纯水.浓缩后的HTF用5%PAGE进行第二次电泳分离.自制微量收
8、集装置:将50kDa超滤管直接放人电转仪阳极端,上方放置切去底部的装有胶块的离心管,直接收集蛋白.电转结束后同样超离收集样品.2.2.2HTF纯度和分子量测定选用分离胶为8%的PAGE鉴定HTF纯度.HTF和DHB(水的饱和溶液)各取1IxL,混匀后取0.8L混合物直接点滴在MALDITOF质谱仪专用样品靶上,待样品自然干燥后,将样品靶放人靶箱内进行分析(MALDITOFReflexIU型,Bruker,德国).选用脉冲氮激光(337nm)离子源,线性模式,加速电压控制在20kV,脉冲宽度2ns,离子延迟时间40s,真空度5.3310Pa,正离子谱测定.多肽测定选用sA基质(新鲜配制的饱和溶液
9、,溶剂为45%乙腈和55%的0.1%三氟乙酸水溶液)为基质,供质谱分析.2.2.3转铁蛋白的全蛋白胶外酶解1IxL10g/L转铁蛋白样品,加入30L乙腈于室温作用30min,抽真空除去乙腈,加入10mmol/L一巯基乙醇,在57条件下孵育1h,蒸干.用20L50mmol/L的NHHCO再次溶解,适当地振荡,超声,加入适量胰酶,37酶解18h.酶解完毕后用0.5%三氟乙酸终止反应,蒸干.最后用2IxL0.5%三氟乙酸(TFA)溶液溶解肽片段,质谱分析,基质为新鲜配制的CHCA(用40%乙腈和60%的0.1%三氟乙酸溶解到饱和).采用高分辩率反射模式,脉冲宽度0.5ns,离子延迟时间20s,其它参
10、数设定同上.数据库检索是在MASCOT(http:/)检索网站,检索参数为:最大允许肽质量误差0.3,允许有1个不完全裂解位点,考虑羟甲基(Hydroxymethy1)和氧化(Oxidation)修饰.2.2.4RP.I-IPLC分离及乙腈处理后的转铁蛋白质谱特性apoHTF的制备参照文献10中脱铁核铁蛋白的制备方法.HTF一2Fe为血清经过铁饱和后提取得到的蛋白样品.铁饱和HTF是HTF-2Fe”经铁过饱和后获得,方法同血清铁饱和.铁饱和HTF,HTF一2Fe和apoHTF分别进行RPHPLC梯度洗脱,洗脱相A(2%乙腈,98%去离子水,0.1%甲酸,0.02%TFA),洗脱相B(95%乙腈
11、,5%去离子水,0.1%甲酸,0.02%TFA),洗脱时间30min,洗脱相B的比例由40%上升到60%,流速为0.5mL/min,检测波长280nm,收集样品,真空干燥,质谱分析.铁饱和HTF,HTF一2Fe和apoHTF各取2IxL,用30L乙腈室温下处理0.5h,质谱分析.3结果与讨论3.1HTF制备与纯度鉴定图1A是经预分离后的人血清蛋白质通过天然梯度PAGE.进一步分离后的电泳图谱.由于人血清HTF属于含铁和高丰度特性的蛋白质,蛋白质颜色呈桔红色,易于肉眼观察.采用铁染色和比对法,易从图1A分离胶中剥离出a条带,再次经PAGE分离得到图1B蛋白质层析带.参考图1B中所显示的蛋白质层析
12、带的数目,位置和分辨率,可清楚看出HTF与其它蛋白较好的分离.图1C结果证实了从图lB中剥离的桔红色条带的纯度,同时看出其迁移率明显高于马脾铁蛋白(Horsespleenferritin,HSF),即HTF分子量明显小于HSF(图1D).第6期卓慧钦等:基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术研究人血清转铁蛋白稳定性及裂解产物7933.2MALDITOF质谱技术测定HTF的分子量和聚合态近期研究表明,采用MALDITOF质谱技术能有效地测定蛋白质(铁蛋白亚基)及有机小分子(儿茶素)聚合体.j.采用MALDITOF质谱技术测定HTF分子量和聚合态,可获得图2a结果.从图中可看出,HTF-2Fe呈现出
13、3个分子离子峰,m/z比值分别为40232.7,79857.5和158492.9,与Busto所报道HTF(美国SigmaAldrich公司产品)研究结果很相似,说明所提取的HTF样品具有较高的纯度与品质.参考前人测定数据J,可推测出图2a中带单电荷HTF(M+H)质谱峰的m/z为79857.5,而m/z40232.7和158492.9分别为带双电荷(M+2H”)和带单电荷二聚态(2M+H)HTF.采用铁饱和处理及类似的分析方法,可获得铁饱和HTF质谱图(图2b),显示出2个分子质子峰,其中m/z比值分别为40431.7和80535.9,其m/z比值比图2a约高出678.4.经比对和推算,可获
14、悉后者HTF络合了2分子Fe(112Da)和1002分子唾液酸组分.这一实验推论与近期报道有关HTF含有唾液酸组成的实验结果很吻合.因此可以认为铁饱和后的HTF易络合血清中的游离唾液酸,它可能有助于提高HTF中铁组分的稳定性.HTF参与转移铁过程中,唾液酸组分可能维持铁稳定的重要作用,反过来铁组分又稳定HTF结构.尽管如此,这些新颖的论点,还有待于进一步深入研究和论证.3.3全蛋白胶外酶解一8芒勺=D*500l00500图1PAGE方法分离HTF的电泳图Fig.1Electrophoreticmapofhumanserumtransferrin(HTF)identifiedbyPAGENGap
15、proachA.HTF和其它杂蛋白(HTFandothermixedprorein);B.从A(a)剥离后的HTF和少量杂蛋白(HTFandlittleproteinseparatedfromA(a);C.二次电泳分离后的HTF纯度鉴定(purificationofHTFseparatedbyPAGEtwicetimes);D.HSF(horsespleenferritin).50000l00000l50000200000m/z口0400005000060000700008000090000/z图2HTF(a)和铁饱和HTF(b)质谱图Fig.2MassspectrogramsofHTF(a)andiron-saturated为了进一步证实实验所提纯的蛋白质样品(图”“1C)为HTF,采用胶外酶解方法,肽指纹及数据库检索技术,鉴定了图1C蛋白样品,并获得该蛋白的肽指纹质谱图(图3).检索结果:蛋白样品与giI37747855Tra
