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1、 上海交通大学医学院博士学位论文上 海 交 通 大 学 医 学 院博 士 学 位 论 文IL-1 对良性脑膜瘤 NF2 基因甲基化的影响及机制研究THE ROLE AND REGULATORY MECHANISM OF IL-1ON THE METHYLATION OF NF2 GENE IN BENIGNMENINGIOMAS作者姓名：王宝锋学导专号：0127209098师：卞留贯 教授业：外科学（神经外科学）提交日期：2015 年 4 月上海交通大学医学院Shanghai Jiao Tong University School of Medicine基金资助项目：上海市科学技术委员会基础研
2、究重点项目（No.12JC1406200） 上海交通大学医学院博士学位论文上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日 上海交通大学医学院博士学位论文上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文
3、被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密，在 年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密。（请在以上方框内打“”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日 上海交通大学医学院博士学位论文IL-1 对良性脑膜瘤 NF2 基因甲基化的影响及机制研究摘 要背景：相关研究显示，慢性炎症与肿瘤的发生、发展与恶化的关系非常密切，特别是 IL-1，做为一种炎症反应中最重要的因子之一，对肿瘤微环境的形成和肿瘤细胞的生存、增殖、侵袭有重要作用。脑膜瘤是颅内最常见的良性肿瘤，大部分脑膜瘤可
4、经手术切除，但由于生长部位或邻近重要结构等原因，仍有 7%-25%的复发率，且目前没有有效的非手术治疗方法，仍需对其病理机制进一步研究以寻找新的治疗方法。NF2 基因失活是脑膜瘤中最常见的基因改变，而 NF2 基因启动子甲基化可能是脑膜瘤发生的重要因素之一，且 NF2 基因及其转录翻译产物 merlin 蛋白与肿瘤生长关系密切。在 NF2 基因的表观遗传学研究中，NF2 甲基化大部分存在于良性脑膜瘤中，占 NF2 基因失活原因的 1/3 左右。目前学者也提出观点，认为表观遗传学改变是慢性炎症与肿瘤发生之间的桥梁。在脑膜瘤中也检测到高表达的 IL-1，但在脑膜瘤中，炎症与抑癌基因甲基化之间的关系
5、目前还没有相关研究。因此，本研究提出假设，炎症（IL-1）可以通过提高良性脑膜瘤 NF2 基因的甲基化水平，抑制 merlin蛋白表达，最终影响脑膜瘤细胞的生长，并探讨其相关机制。I 上海交通大学医学院博士学位论文方法：本研究通过化学消化法建立良性脑膜瘤与柔脑膜原代细胞；采用CCK-8 和 BrdU 实验检测细胞活力和增殖能力；real-time PCR 检测各种基因 mRNA 表达水平；细胞免疫荧光和 Western blot 检测蛋白水平的变化；甲基化特异PCR（MS-PCR）评估NF2基因的甲基化水平；采用DNMTs抑制剂（AZA）、DNMTs siRNA、MAPKs 和 NF-B 信号
6、通路抑制剂（SBSB203580、U0126、SP600125、PDTC）与 IL-1 共处理，验证 DNMTs的作用和相关信号通路。结果：本研究通过临床上收集的良性脑膜瘤标本，成功培养三种良性脑膜瘤原代细胞，并同时培养大鼠柔脑膜原代细胞；采用 LPS 刺激原代细胞，发现炎症刺激能够促进脑膜瘤及柔脑膜细胞的增殖，并刺激炎症因子 IL-1、TNF、IL-6 和 NF-B 的表达；结合相关研究结果显示 IL-1能够引起基因的异常甲基化，本研究选用 IL-1 做为干预因素进一步实验。通过 CCK-8 和 BrdU 实验证实，IL-1 可以增加良性脑膜瘤和柔脑膜细胞的活力和增殖能力；real-time
7、 PCR 和 Western blot 结果提示 NF2 基因表达和 merlin 蛋白表达均明显下降，而 MS-PCR 则显示 IL-1 可以诱导 NF2 基因的甲基化；由于基因甲基化水平主要受到 DNMTs 的影响，为此，本研究观察了 IL-1 对 DNMT1、DNMT3a 和 DNMT3b 的影响，real-time PCR、细胞免疫荧光和 Western blot 均证实 IL-1 处理后良性脑膜瘤细胞 DNMT1 表达明显上升，在柔脑膜细胞中 DNMT1 和 DNMT3b表达明显提高，而 DNMT3a 在所有细胞中均没有明显变化；经过 DNMTsII 上海交通大学医学院博士学位论文抑
8、制剂（AZA）和 DNMTs siRNA 处理后，良性脑膜瘤 DNMT1 和柔脑膜 DNMT1/3b 的表达明显抑制，且 NF2 甲基化水平明显下调，merlin 蛋白表达恢复；但 DNMTs 并不是 IL-1 的直接作用靶点，因此本研究继续探讨 IL-1 影响 DNMTs 表达的机制，IL-1 刺激所有细胞后，MAPK 家族和 NF-B 均被激活，Western blot 显示 p-p38、p-ERK、p-JNK 和 NF-Bp65 表达与 IL-1 均呈剂量依赖效应，而与 MAPKs 和 NF-B 的特异抑制剂共处理后，脑膜瘤 DNMT1 和柔脑膜 DNMT1/3b 表达均受到抑制。结论：
9、综上所述，NF2 基因甲基化是炎症（IL-1）与脑膜瘤发生发展之间的联接点，IL-1 通过 MAPKs 和 NF-B 通路上调良性脑膜瘤 DNMT1和柔脑膜 DNMT1/3b 的表达，提高 NF2 基因的甲基化水平，抑制 NF2基因转录和 merlin 蛋白的表达，最终促进良性脑膜瘤和柔脑膜细胞增殖。本研究结论补充了脑膜瘤发生发展的机制，以 NF2 基因为例阐述了在脑膜瘤的病理机制中炎症、表观遗传学与肿瘤发生发展之间的关系，并为DNMTs 成为脑膜瘤药物治疗靶点提供了理论依据。关键词： 脑膜瘤，柔脑膜，NF2 基因，DNA 甲基化，IL-1，DNA 甲基转移酶III 上海交通大学医学院博士学位
10、论文THE ROLE AND REGULATORY MECHANISM OF IL-1 ON THEMETHYLATION OF NF2 GENE IN BENIGN MENINGIOMASABSTRACTBackground: Previous studies have demonstrated that chronicinflammation has an important role in tumorigenesis, development andprogression. DNA methylation is the major role in epigenetic regulatio
11、n ofgene expression in mammalian and has been proved to be a linker betweenchronicinflammationandcarcinogenesis.Methylationofneurofibromatosis type 2 (NF2) gene is existed mostly in WHO grade Imeningioma and proved to have crucial role in tumorigenesis and tumordevelopment. And aberrant methylation
12、of tumor suppressor gene could beinduced by IL-1. However, the role and mechanism of inflammation onmethylation of tumor suppress gene remains unclear in meningioma. Thepresent study was to investigate how IL-1, one of the pro-inflammatorycytokines in chronic inflammation, promoted NF2 gene promoter
13、methylation by regulating DNA methyltransferases (DNMTs) in benignmeningioma and leptomeninges, and related signal pathways werediscussed.IV 上海交通大学医学院博士学位论文Methods: Primary benign meningioma and leptomeningeal cells werecultured by chemical digestion; CCK-8 and BrdU assay were used toevaluate the ce
14、ll proliferation; mRNA expression of genes was tested byreal-time PCR; Western blot and immunofluorescence technique were usedto investigate the protein expression; the methylation level of NF2 genewas evaluated by methylation-specific PCR (MS-PCR); DNMTs inhibitor(AZA), DNMTs siRNA, MAPKs and NF-B
15、inhibitors (SBSB203580、U0126、SP600125、PDTC) were used to verify the role of DNMTs andrelated signaling pathways.Results: Three primary WHO grade I meningioma cells andleptomeningeal cells were cultured successfully; After treated with LPS,cell viability in all cells were up-regulated, and the expression ofinflammatory factors, such as IL-1, TNF, IL-6 and NF-B, wereincreased; Combined with previous studies that ab
