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1、M008 酵母不对称还原酵母不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯的研究氯乙酰乙酸乙酯的研究 蒋晓霞 林建平 敬科举 刘樱 徐志南 岑沛霖 （浙江大学生物工程研究所，浙江 杭州 310027） 摘摘 要要 从实验室保藏的七株酵母出发，筛选出具有较高产物得率和对映体过量的菌株木兰假丝酵母。 研究了单相体系木兰假丝酵母还原 4-氯乙酰乙酸乙酯时共底物种类及浓度、反应温度、pH 值和底物添加量 等因素对产物得率和立体选择性的影响。单相体系在高底物浓度时底物抑制严重，水/乙酸丁酯两相体系可 降低底物抑制的影响。 关键词关键词 不对称还原 4-氯乙酰乙酸乙酯 (S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯 酵母细胞 对映体过量
2、 ASYMMETRIC REDUCTION OF ETHYL 4- CHLORO- 3- OXOBUTANOATE BY YEAST LIN Jianping, JIANG Xiaoxia, XU Zhinan, JING Keju, LIU Ying and CEN Peilin （Institute of Bioengineering，Zhejiang University，Hangzhou 310027，Zhejiang，China） Abstract: Among the seven yeast strains capable of reduction ethyl 4- chloro-
3、 3- oxobutanoate to ethyl (S)- 4- chloro- 3- hydrobutanoate we screened, Candida magnoliae the highest activity and stereo- selctivity, and was used for the subsequent study. The effects of the co- substrast their concentrations, temperature, pH, as well as the amount of substrate concentration on t
4、he yield and enantiomeric excess (e.e.) of product in mono- phase system were examined in details.While the results show that the use of two- phase system can alleviate the inhibition of both substrate and product Keywords: asymmetric reduction, ethyl 4- chloro- 3- oxobutanoate, ethyl (S)- 4- chloro
5、- 3- hydro butanoate 引 言 手性药物是目前药学界最为关注的话题之一。含手性中心的化合物有多种对映体，它们在 人体内的药理活性、 代谢过程及毒性存在显著差异 1。 具有光学活性的- 羟基酯类手性醇化合物 是一类重要的手性药物中间体2。S- CHBE（ethyl (S)- 4- chloro- 3- hydrobutanoate，(S)- 4- 氯- 3- 羟基 丁酸乙酯）可用于合成HGM- CoA还原酶抑制剂3和- 1，4二氢吡啶类钙离子通道阻断剂等药 物4，具有重要的应用价值。目前，生产手性醇的主要方法有化学法和生物法两种。生物法在 制备高对映体过量的手性化合物方面具有效
6、率高、成本低、装置简单、对环境污染小等优势。 利用酶的立体选择性能够合成一些化学方法难以合成的手性中间体。但在生物法中，辅酶和酶 的价格昂贵，提纯工艺复杂。直接利用微生物活细胞作为生物催化剂与以单一酶作为催化剂相 比有很大的优越性：一方面，微生物细胞具有完整的辅酶再生系统，可以在添加共底物情况下 方便地实现辅酶再生；另一方面，直接利用微生物全细胞不需要分离纯化酶，大大地节约了成 本。 本文从实验室保藏的七株酵母菌株出发， 筛选出具有较高产物得率和e.e.值 （对映体过量值） 的酵母菌株木兰假丝酵母，并对木兰假丝酵母菌株生物转化条件进行优化，提高手性选择 性和产物得率。 1 材料与方法 1.1
7、材料材料 1.1.1 试剂试剂 COBE 和 S- CHBE 标准品购自 ACROS 公司，其它试剂均为分析纯。 1.1.2 菌种菌种 实验菌种为本实验室保藏的酵母菌株。 1.1.3 培养基培养基 斜面培养基(g/L)：葡萄糖 10, 酵母膏 3, 蛋白胨 5，麦芽汁 10 琼脂 20； 种子和发酵培养基(g/L)：葡萄糖 10, 酵母膏 3, 蛋白胨 5，麦芽汁 10 ； 1.2 方法方法 1.2.1 培养方法培养方法 斜面培养：斜面于 30培养箱内培养 23d，4冰箱保存。 种子培养：从新鲜斜面接种一环于 100mL 种子培养基中，摇床（30，200r/min）培养 15h。 摇瓶培养：2
8、50mL 摇瓶中加入 30mL 液体培养基，接入量 5，摇床（30，200r/min） 培养 20h。 1.2.2 还原方法还原方法 单相体系生物催化方法为：摇瓶培养的菌体用 0.9生理盐水洗涤三次，在 50ml 的摇瓶中 加入 10mL 含有底物 COBE 及共底物葡萄糖的磷酸盐缓冲液（pH6.0，100 mM）恒温震荡反应。 两相体系生物催化方法为：在上述单相体系中加入等体积有机溶剂，恒温震荡反应。 1.2.3 分析方法分析方法 单相体系以等体积乙酸乙酯萃取，两相体系取上层有机相，分析产物得率及 e.e.值。产物浓 度分析采用 1790 F 气相色谱仪, 产物 e.e.值分析用 HPLC.
9、 2 结果和讨论 2.1 菌种的筛选菌种的筛选 将酵母湿细胞重悬在 pH6.0 的磷酸盐缓冲液中（细胞浓度为 5g/L） ，加入 COBE，30下振 荡反应 3h 后取样分析。结果如表 1 所示，七株酵母都具有一定的氧化还原能力，但 e.e.值都不 高。本文选择 e.e.值最高的菌株木兰假丝酵母进行以下研究。 Tab 1. The results of reduction of COBE with seven strains of yeast Stain Yield/% e.e./% R/S Baker yeast 92 36 S Candida magnoliae 99 53 S Picha
10、 yeast 93 16 R Saccharomyces cerevisiae(851) 98 22 S Rhodotorula sp 76 32 S Sporobolomyces salmonicolor 96 22 R Saccharomyces cerevisiae(k) 98 25 S 2.2 不同共底物及其添加量对产物得率及不同共底物及其添加量对产物得率及 e.e. 值的影响值的影响 研究表明，在细胞作为催化剂的还原反应中，添加适当的共底物可以促进辅酶再生，有利 于提高得率及 e.e 值5。30时，分别以葡萄糖、蔗糖、乙醇、甘油为共底物，将 5g/L 酵母细 胞悬浮在 pH6.0 的
11、磷酸盐缓冲液中，加入 12.1g/L 的 COBE，反应 3h 后取样分析。结果如图 2 和图 3 所示。 相对于不加共底物时 15.7的得率 23.6的 e.e.值， 添加适量的以上共底物均能一 定程度地提高产物得率和手性选择性，其中葡萄糖作为共底物的效果显著优于其它三种物质。 当葡萄糖浓度为 10g/L 时，产物得率超过 80，e.e.值达到 76.2 。因此，以下的反应中均采 用 10g/L 的葡萄糖作共底物。 2.3 温度对产物得率及温度对产物得率及 e.e.值的影响值的影响 温度是影响酶活的重要因素。5g/L 的木兰假丝酵母重悬于 pH6.0 的磷酸盐缓冲液中，加入 12.1 g/L
12、 的 COBE 和 10 g/L 的葡萄糖，在不同温度下振荡（200r/min）反应 3h 后取样分析。在 2035的范围内，产物得率变化不大，而 40后产物得率迅速减小。这是因为随着温度的 升高，反应速度加快，转化率增加，但温度超过一个临界值后，可能使部分酶失活，反应速率 降低。随着温度的升高，产物 e.e.值略有增加，这可能是随温度的升高，酵母中能使 COBE 转 化为(R)- CHBE 的酶失活得更快，从而使 e.e.值有所升高。从产物得率和 e.e.值综合考虑，30 为最佳的反应温度。 2.4 pH 值对产物得率及值对产物得率及 ee 值的影响值的影响 将 5 g/L 假丝酵母细胞悬浮
13、于不同 pH 的磷酸盐缓冲液中， 加入 12.1 g/L 的 COBE 和 10 g/L 的葡萄糖，30振荡（200 r/min）反应 3h。结果表明，在 pH3.08.0 的范围内，产物得率及 e.e. 值均较大，尤其以 pH6.0 时最佳。但是在 pH 值超过 9.0 后，产物得率很低，这可能是由于底物 在碱性条件下不稳定，迅速分解所致6。 2.5 底物的投加量对产物得率及底物的投加量对产物得率及 e.e.值的影响值的影响 在于 2.5 同样的反应条件下，考察不同的 COBE 加入量对反应的影响。随底物浓度增加， 产物得率以及 e.e.值均呈降低趋势，特别是在底物浓度超过一个临界值（约 1
14、2g/L）后，产物得 率及 e.e.值均剧烈下降。 这说明 COBE 对羰基还原酶有强烈抑制作用7。 而超过某一临界值抑制 作用加重的现象还预示着抑制物与酶的结合似乎是正协同的。 2.6 单相和水乙酸丁酯两相体系的比较单相和水乙酸丁酯两相体系的比较 单相体系底物抑制严重，两相体系有望降低底物抑制的影响。24.2g/L 的 COBE 分别分一次 或两次加到单相体系和水/乙酸丁酯两相体系中进行反应（表 2），产物得率及 e.e.值在两相体系 都有大幅度提高。 这是因为 COBE 和 CHBE 在水/乙酸丁酯有较高的分配系数， 其值分别为 10.6 和 15.8，大大降低了水相中 COBE 的浓度，
15、降低了底物抑制的影响。这说明水/乙酸丁酯两相体 系在高底物浓度时优于单相体系。 Tab. 2 Comparation of monophase system and diphase system monophonic diphasic Addition of substrate Yield/ e.e./ Time/h Yield/ e.e./ Time/h oncely(24.2g/L) 12.27 43.27 6 30.56 73.3 30 twicely (24.2g/L) 27.89 49.65 6 55.81 73.9 30 3 结 论 从实验室保藏的 7 株酵母菌株中筛选出具有较高还
16、原能力和手性选择性的菌株木兰假 丝酵母。 在单相体系中优化木兰假丝酵母的生物转化条件， 30， 5g/L 的木兰酵母酵母在 pH6.0 的磷酸钾缓冲液(100 mM)中添加 10 g/L 共底物葡萄糖振荡转化时，能将 12.1g/L 的 COBE 转化 为 S- CHBE，且 e.e.值为 76.3。水/乙酸丁酯两相体系中，在提高总底物浓度的情况下，实现 高的产物得率及 e.e.值。 References 1 You Tainpa(尤田耙). Modern study Method of Chiral Compound (手性化合物的现代研究方法)，Hefei: University of science and Technology of China Press ,1993 2 Ou Zhimin, Wu Jianping, Yang Lilong, Cen Peilin. Production of Chiral Alcohol byMicrobial Reduction
